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标题:【讨 论】蛋白纯化讨论

66小飞侠[使用道具]
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【讨 论】蛋白纯化讨论


这几天忙着纯化一个蛋白,找了一些资料。希望对大家有用,也希望大家讨论讨论。
The Recombinant Protein Handbook
-- Protein Amplification and Simple Purification

下载 cuturl('http://gene.tmmu.com.cn/dxy/protein_purification/PHARMACIAHandbookProteinPurification.pdf')
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66小飞侠[使用道具]
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亲和层析应该说是目前较好的纯化方法。PHARMACIA在这个领域有较深的基础

Principles and Methods
----Affinity Chromatography
下载 cuturl('http://gene.tmmu.com.cn/dxy/protein_purification/PHARMACIA-AffinityManual.pdf')
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基因组让人们发现很多基因。但蛋白质却是生命活动的执行者,后基因组时代人们面临着基因的表达调控及表达产物(蛋白质)的纯化问题。如果要将基因或蛋白产业化,纯化和数量也是一个问题。

原核表达量大,但由于原核生物的局限,很多没有活性,蛋白不能正确折叠。

真核表达一般能保证活性,但蛋白的量相对少。

维持活性或高表达量似乎是二者不可兼得。

目前有研究尝试将原核表达的蛋白让其重新折叠,来解决活性和表达量的矛盾。

附件是一篇关于refolding的2003年综述,供参考
Practical considerations in refolding proteins from inclusion bodies
cuturl('http://gene.tmmu.com.cn/dxy/protein_purification/Tsumoto2003.pdf')
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ero11[使用道具]
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以前做过亲和层析,感觉亲和层析虽然得到的产品纯,但这个纯是以产率低做为代价的。对于一般的研究用蛋白纯化还好,如果用于生产就太贵了。而且普遍来说,亲和层析的上样时间长,流速慢,不宜于大规模蛋白提纯。
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duoduo[使用道具]
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5
 
这套书是安法玛西亚的产品说明,
在该公司网站上免费下载的,
好象共有15本,现在手头有10本,

等新家建成我全部奉献,
其实类似的书俺有几百本,
都是在各处收集的。
在适当的时候会拿出来的。
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66小飞侠[使用道具]
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以前做过亲和层析,感觉亲和层析虽然得到的产品纯,但这个纯是以产率低做为代价的。对于一般的研究用蛋白纯化还好,如果用于生产就太贵了。而且普遍来说,亲和层析的上样时间长,流速慢,不宜于大规模蛋白提纯。

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亲和层析确实只能适用于研究,做产业可能够呛。主要的原因是上样时间长,流速慢;

但产率低我到没有觉得,亲和层析的结合是很牢固的,我认为产量低的原因可能是表达量本身低。目的蛋白在上样液中的绝对含量少所致。不过满足试验研究用还是够用,大规模生产当然不行。

上样时间长,流速慢的问题可以考虑在上样前先浓缩一下,减少上样量。流速最好不要太快,快了影响得率。

目前用于生产的可能还是原核表达,用发酵罐来整。refolding可能有助于其表达蛋白活性的恢复,但真核表达的优势除了蛋白能有效折叠外,还能对蛋白糖基化。原核蛋白如何糖基化?记得CP中有过介绍。

亲和层析中开始液和洗脱液的选择很重要,如果不合适,会影响得率和蛋白活性。虽然有些手册有介绍,不知大家有何高见?
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qhyu[使用道具]
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7
 
真核表达当然还是最理想的,用于研究是离不开真核表达的。原核表达现在仍然是不可替代的,因为它的经济性。

亲和层析分很多种,不同的亲和柱子相对于不同种类的蛋白,会有完全不同的结果。金属鳌合柱之类的,对蛋白的专一性很高,不象DEAE等阴离子阳离子交换柱,应用的范围广。我以前用的是免疫亲和层析柱,只能用一个词来形容:TOUGH。对于不同柱子,柱子长,柱子直径,填料多少,所挂抗体的密度,所有的都会直接影响柱子的参数,加上上样样品的浓度,离子强度,也会直接影响抗原抗体的结合。以我的经历奉劝大家,有些在理论上很简单的实验,到了实际上可能是完全不同的,能不用免疫亲和的就不用。
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