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标题:【求助】如果蛋白降解，我该怎么办？

eric930[使用道具]
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发表于 2013-11-26 16:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】如果蛋白降解，我该怎么办？


如果蛋白降解，我该怎么办？还用重新从组织块中提取吗？我的组织很难找到的。谢谢！
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wmp1234[使用道具]
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发表于 2013-11-26 16:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果确信蛋白提取出来以后降解了，那替你惋惜，只能重新去提取
这时候你就要分析是什么原因造成了它的降解，是不是环境中存在的蛋白酶呢？
如果是的话，那下次再提取的时候就要在提取液中加入蛋白酶抑制剂，有几种，好像还有什么PMSF
试试看
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eric930[使用道具]
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发表于 2013-11-26 16:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的蛋白电泳昨天还是好好的，电泳结束以后有很漂亮的条带，一夜之间就全变了，在胶上只能见到涌到，其他什么带都都没有，包扩我新处理的蛋白，也不知道是为甚么，而且我提取时加入pmsf了，od直也测出来了呀，能帮帮我吗？不胜感激。
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remonte[使用道具]
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发表于 2013-11-26 16:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也遇到过这种事,不过没有这么严重,我的出现了很多杂带.

我是由于两次跑的胶浓度不同产生了不同的分离情况.

你的情况可能是降解了,这样OD值不会策不出来,但是却没有条带.

另外,你的蛋白如何保存?冻熔后有无沉淀产生?

再跑一次看看吧,然后再确定原因.
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831226[使用道具]
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发表于 2013-11-26 16:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我实验中也有遇到过这样的情况，当时我们重新配了上样buffer和丙稀酰胺后就好了。此外，样品保存也很重要，我通常是提取的蛋白质分装后一部分直接-70保存，一部分加buffer煮沸后-70保存，总不会两种条件下的东西都降解吧。
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33号[使用道具]
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发表于 2013-11-26 16:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

蛋白降解了还有用吗？只能重新提取了
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remenb[使用道具]
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发表于 2013-11-26 16:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
首先确定你提取的蛋白质是否降解了。如果是的话，我只能对你表示同情！

我说说我们提取蛋白质的一些情况，希望对你下一次再提取时有点帮助：
1.在提取蛋白质过程中最好连续，整个过程最好在4度下进行；在接触蛋白质的缓冲液或其他试剂中都加一点蛋白酶抑制剂（如PMSF等）防止蛋白质的降解，有时在透析液或其他溶液中也要加入抑菌试如叠氮钠）。
2.提取的蛋白质原液最好浓缩一下（我们用浓缩膜浓缩的），蛋白质在稀溶液中更容易降解。
3.在做完电泳、westblot、测定蛋白质的浓度后就及时分装保存。
4.直接的纯化的蛋白质溶液保存也相对容易降解，你可以采取蛋白质干粉可以-20度保存。
5.液态保存蛋白质时加甘油保护-20度也可以保存，如果你短时间不用，建议-70度保存备用。
最后祝你好运！
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30moonriver[使用道具]
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发表于 2013-11-26 16:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

因为我的蛋白样品天天用所以放在4度冰箱里，有一部分冻在－20但是动容后也没有沉淀产生，今天我重提了蛋白跑完的结果还是一样的没有带的。重新配制电泳缓冲液和丙稀酰胺后有点带了，但是也不像原来那么漂亮清楚了。上样buffer一直保存在4度，每次都用他调浓度，他对蛋白的影响会很大吗？
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remenb[使用道具]
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发表于 2013-11-26 16:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

蛋白样品天天用，应该分装成小包装，在－20度保存，况且避免蛋白质的反复冻溶是保存的一个常识，不仅使其容易降解，也难以保证其蛋白质的生物活性。
各种试剂最好不要放置太长时间，因为起PH值等都会有所变化，影响电泳效果。
上样buffer当然可以在4度保存，我不明白你：“上样buffer一直保存在4度，每次都用他调浓度”是什么意思，上样buffer能调蛋白质浓度？（我们的聚丙稀酰胺凝胶电泳的上样2×buffer是这样的：1 mmol/M Tris-HCL ph6.8 2.5ML,β-巯基乙醇1.0ml,SDS 0.6克，甘油2.0ml，0.1%溴酚蓝1.0ml，双蒸水3.5ml)。

最后祝你好运！
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guagua[使用道具]
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发表于 2013-11-26 16:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我保存蛋白一般都是先分装成20μl/EP管，保存在-70℃，用的时候就拿一管，这样蛋白就不容易降解了！希望对你能有所帮助：GOOD LUCK！
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