小中大【讨论帖】In cell Western
和大家再分享讨论一项技术，In-cell Wstern。
说白一点，In-cell western就是利用不同的抗体，直接将细胞在96孔板上进行蛋白表达的检测，但是检测原理与Western类似（其实和ELISA也差不多吧）。
可参考网页：
cuturl('http://www.cellsignal.com/ddt/licor.html')
优势：
最明显的优势大概就是高通量了，至少一次检测了96个样品的蛋白水平，有利于检测剂量关系；
可以利用不同荧光标记的二抗来双染；
比Western的定量效果要好；
操作比Western简便；
另外，不知能否直接看到细胞内蛋白的分布，类似作免疫组化？（这个是我猜想，还没有实际操作，但是最近会尝试，有结果再来讨论~~~）
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缺点：
什么试验都会有不足的，这个与Western比较，不能区分出蛋白的分子量了；
而且对抗体的要求会比较高，特异性要好；
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大概的操作步骤流程：
1。以一定密度包被细胞于96孔细胞板上培养；
2。生长到合适密度后，加药物或其他处理；
3。一定时间后，用4%多聚甲醛（？）固定；
4。1-3% BSA封闭30 min（如果胞内蛋白，也许需要加入0.1% triton 15 min打孔）；
5。合适浓度1抗 1h（如果双染的话，不知是同时加好还是分开加好？）
6。合适浓度2抗 30 min
7。检测
实际操作过一次，单染的，最后用的AP标记的二抗然后显色的，基本上有些结果，有趋势，但不理想。
下面准备换用不同用荧光标记的二抗在一个孔内同时检测目的基因和Actin。
如果有好的结果或者有问题会随时发布在这里，希望有做过的指点！欢迎大家讨论~~~~
