维生素B1的测定——荧光计法(二)

关键词:农兽药残留检测
无烟煤成分分析
国产标准品  优级纯试剂GR

4.操作步骤


①样品提取


a.水解:精确称取已打成匀浆或粉碎好的试样5~10 g(含硫胺素约为10~30µg),置于150 m L三角瓶中,加人50~75 m L0.1mol·L -1盐酸使其溶解,瓶口用倒置小烧杯盖好后放入高压锅中加热水解130 min。冷却后,滴加2mol·L -1乙酸钠,边滴边取出少许,用0.04%溴甲酚绿检验,呈草绿色时为止,pH为4.5。


b.酶解:按每克试样加入20g淀粉酶的比例加入淀粉酶,于45~50℃温箱保温16 h。冷到室温,定容至100 mL,混匀,过滤,即为样品提取液。


②净化:将少许脱脂棉铺在盐基交换管底部,加水将脱脂棉中气泡赶出。加l g左右活性人造浮石使之达到交换柱的1/3高度,保持盐基交换管中液面始终高于活性人造浮石。用移液管加入样品提取液20~80 mL(使通过活性人造浮石的硫胺素总量约为2~5µg)。加入10mL热水冲洗交换柱,弃去洗液,如此重复三次。加入25%酸性氯化钾(温度为90℃左右)20mL,收集此液于25 mL刻度试管内,冷至室温,用25%酸性氯化钾定容,得样品净化液。


将20 m L一硫胺素标准使用液加入盐基交换管代替样品提取液,重复上述操作,得标准净化液。


③氧化:将5 mL试样净化液分别加入A、B两个Malizel—Gerson反应瓶。在避光条件下,A瓶加3 mL 15%氢氧化钠溶液,振摇15s后加入10 mL正丁醇;B瓶加3 m L碱性铁氰化钾溶液,振摇15 s后也加入10 mL正丁醇。同时用力振摇两个反应瓶,准确计时15 min。得样品空白和样品液。


用标准净化液代替样品净化液重复上述操作,得标准空白和标液。


用黑布遮盖各反应瓶,静止分层后弃去下层碱性溶液,加2~3 g无水硫酸钠脱水。


④荧光强度的测定:在激发波长365 nm;发射波长435 nm;激发狭缝、发射狭缝各5 nm条件下,依次测定样品空白、标准空白、样品、标液的荧光强度。


5.计算


X= (cV/m)*[(U-UB)/(S-SB)]*(V1/V2)*(100/1000)


式中:X——样品中硫胺素含量,mg/100g,1国际单位=3µg维生素B1;


   U——样品荧光强度;


   UB——样品空白荧光强度;


   S——标准荧光强度;


   SB一——标准空白荧光强度;


   c一一硫胺素标准使用液浓度,µg·m L-1;


   V——用于净化的硫胺素标准使用液体积,m L;


V1——试样水解后定答之体积,mL;


   V2——用于净t匕的样品提取液体积,mL;


   m——试样质量,g。


6.说明


①一般食品中的维生素B1有游离型的,也有结合型的,即与淀粉、蛋白质等结合在一起的,故需用酸和酶水解,使结合型B1成为游离型。


②硫胺素在碱性条件下被铁氰化钾氧化成黄色噻嘧色素,振摇15 s是使其充分反应,这期间应保证黄色不褪以证明铁氰化钾用量充足,否则应再滴加铁氰化钾溶液1~2滴。因为样品中如含有还原性物质,而铁氰化钾用量不够时,硫胺素氧化不完全,给结果带来误差。但过多的铁氰化钾会破坏硫色素,故其用量应恰当控制。


③硫色素能溶于正丁醇,在正丁醇中比在水中稳定,故用正丁醇等提取硫色素。萃取时振摇不宜过猛,以免乳化,不易分层。


④紫外线破坏硫色素,所以硫色素形成后要迅速测定,并力求避光操作。


⑤用甘油一淀粉润滑剂代替凡士林涂盐基交换管下活塞,因凡士林具有荧光。


⑥谷类物质不需酶分解,样品粉碎后用25%酸性氯化钾直接提取,氧化测定。


⑦氧化是操作的关键步骤,操作中应保持加试剂的速度一致。