蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】蛋白纯化后，缓冲中的咪唑是否影响细胞测活？

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 17  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】蛋白纯化后，缓冲中的咪唑是否影响细胞测活？

豆龟[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 114525
精华 0
积分 233
帖子 185
信誉分 100
可用分 1706
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态 离线
1

发表于 2013-11-29 10:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白纯化后，缓冲中的咪唑是否影响细胞测活？


各位战友，最近纯化一批蛋白，想用来做一下体外测活。但是蛋白是用镍柱纯化的，最后收集的样品缓冲中含有咪唑。
虽然用超滤管浓缩过，但是无法保证咪唑已经除干净了，在此请教一下，残余咪唑是的否影响体外细胞测活？或者影响蛋白的抑菌活性?
估计残余的咪唑浓度在45mM以下。
顶部
豆龟[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 114525
精华 0
积分 233
帖子 185
信誉分 100
可用分 1706
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态 离线
2

发表于 2013-11-29 10:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

应该更低，在30mM以下。
顶部
tangxin_80[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79896
精华 0
积分 549
帖子 757
信誉分 100
可用分 4621
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-17
状态 离线
3

发表于 2013-11-29 10:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议透析，然后浓缩。
顶部
duoduo[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74511
精华 0
积分 705
帖子 1009
信誉分 100
可用分 5926
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-11
状态 离线
4

发表于 2013-11-29 10:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

把浓缩的蛋白用与细胞实验匹配的缓冲液稀释,然后再浓缩.....你要是还不放心就多重复一次...

你最开始的时候imidazol的浓度是多少?? 300mM,500mM?? 超滤管的膜可以耐受么? 我最近有这方面的困惑.
顶部
yes4[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77377
精华 0
积分 764
帖子 1145
信誉分 101
可用分 6575
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-16
状态 离线
5

发表于 2013-11-29 10:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
最开始45mM。
超滤管应该耐受咪唑吧？
顶部
summerxx[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75852
精华 0
积分 885
帖子 1388
信誉分 101
可用分 7783
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-28
状态 离线
6

发表于 2013-11-29 10:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

在超滤管里面洗不可以吗？用缓冲液反复清洗几次超滤管，应该可以洗干净的。
顶部
小野花[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76741
精华 1
积分 299
帖子 293
信誉分 102
可用分 2211
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-9
状态 离线
7

发表于 2013-11-29 10:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
最开始45mM。
超滤管应该耐受咪唑吧？

========================================

如果太高是不可以的...我印象中标好象是300mM.....
顶部
小野花[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76741
精华 1
积分 299
帖子 293
信誉分 102
可用分 2211
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-9
状态 离线
8

发表于 2013-11-29 10:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
在超滤管里面洗不可以吗？用缓冲液反复清洗几次超滤管，应该可以洗干净的。

==================

就是在超滤管呀...
顶部
7437654[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 107983
精华 0
积分 307
帖子 313
信誉分 100
可用分 2366
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-4-27
状态 离线
9

发表于 2013-11-29 10:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也有相似的困惑，纯化的蛋白如何去除干净咪唑啊？
用超滤管的话，在离心的过程中产生了大量的蛋白沉淀，真麻烦呢！
希望大侠解答啊
顶部
abc816[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77362
精华 0
积分 775
帖子 1190
信誉分 100
可用分 6817
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-16
状态 离线
10

发表于 2013-11-29 11:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果你要测活的话，最好要先对你纯化的蛋白进行除盐，去除小分子干扰物。
除盐，去除小分子干扰物的方法有很多，这里我就说说适合你的方法。
第一，因为你手头上有超滤管，这个东西除了能浓缩蛋白，还有一个很重要的功能就是更换缓冲液，去除小分子。你选用3KD的超滤管，边浓缩边加入你测酶活想选择的缓冲溶液，重复几次的话，这样就能达到你去除咪唑的目的。
第二，GE的除盐柱，如sephadexG25等，10分钟内就能完成更换缓冲溶液的目的。这个要有色谱系统或横流泵，这两者都没有的话，也可以用注射器手动实现。
第三，透析，这个我就不多说了。
顶部
 17  1/2 12››