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标题:【求助】95蛋白做了1个月，还是什么都没有！

standup[使用道具]
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发表于 2013-12-1 11:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】95蛋白做了1个月，还是什么都没有！

超级干净，这种条件都摸索过了，包括蛋白重新提取，考马斯也染过有条带！0.22和0.45的膜都用过了，转膜各种常

用电流，时间都用过，marker每次都有，这个至少能说明有理论上有一点点条带吧。现在就只剩下抗体了！

一个指标一抗是：abcam的 1：1000

一个指标一抗是：santa公司的 1：800

内参是actin， 甚至连内参都没出来！1：1000

二抗都是红外抗兔，买的国产的。

试剂不是本人买的，但是都是新的！1：5000

我个人认为失败原因在于：一抗和二抗不结合。

我想知道是否我漏了什么很细节，确实相当重要的步骤，但是也不至于什么都没有啊，相当干净！关于一抗和二抗，希望大家不吝赐教！
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发表于 2013-12-1 11:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

蛋白标本怎么样？


有时候蛋白降解，卡马斯亮蓝 也会有条带（会有弥散而不是很锐利的带），但是目的蛋白做不出来，甚至是内参也做不出来，白板一片。
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发表于 2013-12-1 11:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是细胞吗？有人actin作内参也没做出来，GAPDH就做出来了
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发表于 2013-12-1 11:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果你一抗、二抗没问题，那么你蛋白处理过程说的不详细，很有可能某处有遗漏，这是关键点。
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ffaa[使用道具]
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发表于 2013-12-1 11:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果怀疑二抗有问题
跑胶的时候点个一抗 验证一下不就行了
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standup[使用道具]
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发表于 2013-12-1 11:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 ffaa 于 2013-12-1 11:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

如果怀疑二抗有问题
跑胶的时候点个一抗 验证一下不就行了

怎么点？能说的具体一些吗？
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ffaa[使用道具]
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发表于 2013-12-1 11:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 standup 于 2013-12-1 11:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


怎么点？能说的具体一些吗？

就是把一抗作为样品 电泳转膜，杂二抗，如果能检测到一抗的轻重链说明二抗和一抗的结合应该没问题
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txwuyan[使用道具]
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发表于 2013-12-1 11:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
要不你把你的考染图，上传来看看呢。

可以先解决内参的条带问题，再说你的样本的问题。

你可以让做得好的同学帮你做一次，或者你用别人已经做出来的样本，你用你的方法和试剂做一次，对比找下原因。
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purrr[使用道具]
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发表于 2013-12-1 11:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的封闭时间是多少，我们实验室也曾经出现过白片的问题，那个做实验的人偷懒，在4°封闭时间过长，也都是白片。另外，你转膜后，可以用立春红染色看一看你的目的条带确实转在膜上了。
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standup[使用道具]
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 小中大
就是把一抗作为样品 电泳转膜，杂二抗，如果能检测到一抗的轻重链说明二抗和一抗的结合应该没问题

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是稀释多少比例后的抗体呢？如何让检测？不明白？麻烦赐教呀
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