蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】酵母MD平板选择的原理是什么?

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】酵母MD平板选择的原理是什么?

yyaxw84[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 114481
精华 0
积分 307
帖子 334
信誉分 100
可用分 2444
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态 离线
1

发表于 2013-12-1 22:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】酵母MD平板选择的原理是什么?


我用毕赤酵母表达蛋白质,其中用MD平板筛选酵母,并且接着用G418YPD平板筛选,用G418是因为我的克隆质粒里带有该抗性,但我不明白为何用MD平板筛选?目的是什么?原理又是什么?谢谢赐教.
顶部
xiaoxiaoniao[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 108878
精华 0
积分 509
帖子 677
信誉分 100
可用分 4049
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
2

发表于 2013-12-1 22:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这种方法是依据Mut+和Muts的生长情况观察并判断转化子的表型。
Mut+表型在MD和MM板上均能正常生长，两者菌落大小没有明显区别；
Muts表型利用甲醇较慢，在MM板上生长缓慢或几乎不生长，菌落明显小于MD板上相应菌落。
顶部
zhihui小新[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 108883
精华 0
积分 276
帖子 252
信誉分 100
可用分 1968
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-5-15
状态 离线
3

发表于 2013-12-1 22:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

MD平板中以葡萄糖作酵母生长中的碳源生长,无论Mut+和Muts都可以充分利用葡萄糖为碳源,而MM则提供甲醇为碳源,所以在筛选过程中,在MM上生长的菌则可以正常利用甲醇作碳源生长,反之则是甲醇缓慢生长型
顶部
yyaxw84[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 114481
精华 0
积分 307
帖子 334
信誉分 100
可用分 2444
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态 离线
4

发表于 2013-12-1 22:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我认为解释应该是这样的:MD平板是组氨酸缺陷的,未经转化的酵母(M15)在MD平板上是不能正常生长的,只有成功转化的带有外源质粒(我用的PPIC9K质粒)的酵母才能在MD平板上生长,这样就做到了筛选出我所需要的表达酵母,通过G418的抗生素筛选可以进一步筛选到优良的表达菌株.这是我师兄给我的答案.
顶部
kswl870[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77250
精华 0
积分 559
帖子 755
信誉分 101
可用分 4621
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
5

发表于 2013-12-1 22:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我认为解释应该是这样的:MD平板是组氨酸缺陷的,未经转化的酵母(M15)在MD平板上是不能正常生长的,只有成功转化的带有外源质粒(我用的PPIC9K质粒)的酵母才能在MD平板上生长,这样就做到了筛选出我所需要的表达酵母,通过G418的抗生素筛选可以进一步筛选到优良的表达菌株.这是我师兄给我的答案.

=========================

我觉得这个解释得比较清楚。
顶部
kswl870[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77250
精华 0
积分 559
帖子 755
信誉分 101
可用分 4621
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
6

发表于 2013-12-1 22:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 kswl870 于 2013-12-1 22:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我认为解释应该是这样的:MD平板是组氨酸缺陷的,未经转化的酵母(M15)在MD平板上是不能正常生长的,只有成功转化的带有外源质粒(我用的PPIC9K质粒)的酵母才能在MD平板上生长,这样就做到了筛选出我所需要的表达酵母,通过 ...

这个在invitrogen网站上都有说明，可以去看看，下载手册。
顶部
misswu61[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79547
精华 0
积分 747
帖子 774
信誉分 100
可用分 4691
专家分 100
阅读权限 255
注册 2011-12-13
状态 离线
7

发表于 2013-12-1 22:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
认为解释应该是这样的:MD平板是组氨酸缺陷的,未经转化的酵母(M15)在MD平板上是不能正常生长的,只有成功转化的带有外源质粒(我用的PPIC9K质粒)的酵母才能在MD平板上生长,这样就做到了筛选出我所需要的表达酵母,通过G418的抗生素筛选可以进一步筛选到优良的表达菌株.这是我师兄给我的答案.

==============================================================================================================

我也觉得这样解释较好，我还补充一点，并不是在MD上长的都是阳性菌落，也有假阳性，通过G418就可以大部分剔除假阳性了。试想为什么不可以把G418加在MD平板上一次性筛选呢？我觉得可以这样解释：一般筛选转化子都需要经过“中间培养”这一过程，即要进行传代几次后才能筛选到转化子，因为大多数转化子都有一个“表型延迟现象”（主要是因为微生物细胞内原有酶量远远高于目的基因表达的酶量，因而一个突变性状往往在表型上显现不出来）。在进行G418筛选之前不是要在细胞培养板上转代好几次吗？我想道理就在此。开始我也想不通，后来根据本科学的知识，想到了这点。“中间培养”对筛选和获得稳定的菌株都是极为重要的，一般要经过至少3代以上！不知说得对不对，望大家探讨！！！
顶部
yyaxw84[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 114481
精华 0
积分 307
帖子 334
信誉分 100
可用分 2444
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态 离线
8

发表于 2013-12-1 23:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
哈哈,楼上的说得对极了,如果刚一开始就加G418的话,很有可能筛选不到所要的菌株.我用的筛选系统就要经过好几步筛选,首先是在YPD平板上,不加G418,然后是0.5mg/ml的G418 YPD平板,接着是1mg/ml,2mg/ml,最终是4mg/ml,就是逐步筛选出优良菌株,同时也降低假阳性.
顶部
yyaxw84[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 114481
精华 0
积分 307
帖子 334
信誉分 100
可用分 2444
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态 离线
9

发表于 2013-12-1 23:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

补充一下:
巴斯德毕赤酵母的载体是整合型载体，常见的载体包含醇氧化酶-1(AOX1)基因的启动子的转录终止子(5’AOX1和3’AOX1),他们被多克隆位点分开,外源基因可在此插入,此外，载体中还包含组氨酸脱氢酶基因(HIS4)选择标记（HIS4区的整合方式为位点特异性单交换引起的基因插入，整合后使组氨酸缺陷型宿主（his4）恢复野生型.HIS4区或AOX1区位点的整合都使转化子具有HIS4基因，因而可利用表型差异进行筛选，酵母GS115具有组氨醇脱氢酶缺陷型基因his4，可接受含HIS4的载体而具有HIS＋表型以筛选转化子.）及3’AOX1区,当整合型载体转化受体菌感受态细胞时,他的5’AOX1和3’AOX1能与染色体上的同源基因重组,从而使整个载体和外源基因插入到受体菌染色体上，在加入甲醇作为唯一碳源的培养基中,外源基因在5’AOX1启动子的控制下表达.在载体中引入Tn903Kanr基因(抗G418)有助于筛选高拷贝转化子,转化子的拷贝数与抗G418的能力有关,通过筛选抗G418能力强的酵母即可获得高拷贝转化子.外源基因是以同源重组的方式插入到酵母菌的染色体中,因此不易丢失，多次传代后酵母仍能稳定表达外源蛋白，具有良好的遗传稳定性.
顶部