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标题:【讨论帖】谈谈DTT在蛋白纯化和保存中的作用

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发表于 2013-12-1 23:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【讨论帖】谈谈DTT在蛋白纯化和保存中的作用

我们知道Cys存在与许多蛋白中，且其中的－SH常作为活性中心发挥作用，或者，两个－SH连接成二硫键，是维持蛋白质高级构象重要桥梁。
－SH具有很强的还原性，溶液被溶液中的溶解氧或其它氧化物氧化，从使蛋白失去活性。
所以，在蛋白纯化和保存时，在溶液中加入一定量的DTT，以免蛋白－SH被氧化而失活。
但这里就有一个矛盾，DTT该加多少量，以使－SH保持还原状态，而使二硫键免遭还原？
除了上述作用，DTT还有哪些方面可以起到作用？
我的知识面非常有限，请各位战友多多指教。
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发表于 2013-12-1 23:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
也可以谈谈其它相关的，比如说重金属离子会与－SH发生反应，生成硫醇盐，因此可以在溶液重添加适量EDTA，螯合掉金属离子。
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 小中大

According to my experience and experiment data, one cys should be added 5 times DTT.
Usualy, we add ten times DTT, and that really work to keep proteins stable .
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发表于 2013-12-1 23:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 33号 于 2013-12-1 23:07 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

According to my experience and experiment data, one cys should be added 5 times DTT.
Usualy, we add ten times DTT, and that really work to keep proteins stable .

这个很对！
我也曾听一高人说起过，以摩尔数计算，5-10倍的量来保护－SH。
不过我想GSH是不是有一样的效果？
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发表于 2013-12-1 23:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果蛋白报存buffer中含有15％左右的甘油，对蛋白具有很好的稳定作用。
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发表于 2013-12-1 23:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

呵呵，补充一点：如果dtt和蛋白摩尔比例比例增大到1：100，DTT就能破坏2硫键了，这时对应的浓度一般在10mM左右，这个一般在做还原肽图的时候用到。
不过有些分子内的二硫键由于空间位阻的作用，还原剂的量增加到很大也不能破坏。这时可能要配合尿素等变性剂才能彻底打断二硫键（如包涵体变性）
DTT在离子状态才有作用，在pH7-9.5的时候作用最强，pH降到3以下几无电离，因此可以通过降低pH至3以下来终止DTT作用。
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发表于 2013-12-1 23:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
现在才知道DTT作用还受到pH的影响。
提到尿素变性，要是蛋白存在分子间或分子内二硫键，即使具有高浓度的尿素或盐酸胍，而没有DTT等还原剂，那是否也不能使蛋白完全变性（断裂二硫键）？
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发表于 2013-12-1 23:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果蛋白报存buffer中含有15％左右的甘油，对蛋白具有很好的稳定作用。

================================================================

我记得有篇“从纯化到星辰”文章中提到“万金油”配方是这样的:

50mM Tris pH 7.9
0.5mM EDTA
50mM NaCl
5% glycerol　　

笔者用该配方复性某个蛋白，比某个试剂盒中十几种buffer的效果都好。
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发表于 2013-12-1 23:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们实验室最近也用了DTT做蛋白裂解，很关注。。。。
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发表于 2013-12-1 23:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 leifengta 于 2013-12-1 23:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我们实验室最近也用了DTT做蛋白裂解，很关注。。。。

DTT裂解蛋白？还是裂解细胞？还是……？
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