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标题:【求助】包涵体纯化的问题

langlang[使用道具]
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发表于 2013-12-2 00:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】包涵体纯化的问题

我表达的蛋白是包涵体形式，在大肠杆菌中的融合表达，标签为GST！

1.我想请问下，我纯化蛋白按照用梯度沉淀法，用盐酸胍将蛋白洗涤后可以直接上柱子纯化吗？还是先做复兴呢

2.除用盐酸胍梯度沉淀法外，还有哪种方法对洗涤蛋白较好呢？

希望大家多提宝贵意见！谢谢
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chuntian1983[使用道具]
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发表于 2013-12-2 00:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
盐酸胍将蛋白洗涤后不可以直接上柱子纯化，先复兴
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birdfish[使用道具]
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发表于 2013-12-2 00:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
包涵体现在还有什么做下去的必要吗？即使纯化出来，复性了，免疫原性的效果也不好。我建议楼主不要浪费时间了。

至于包涵体纯化，现在已经是非常成熟的技术了。只要做过蛋白纯化的人，都知道怎么来做。而且GE公司的小册子上写的也很清楚，你可以参照GE公司的纯化柱来进行试验。
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langlang[使用道具]
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发表于 2013-12-2 00:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还有个问题，我发现上清中也有表达，破碎后将上清直接上GST柱纯化，我用了1ml树脂，想问下用洗脱缓冲液加多少合适呢？加1ml多吗？
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yes4[使用道具]
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发表于 2013-12-2 00:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

重力流或者试管离心法，每次加1-2ml，分别收集洗脱液，电泳检查。

上纯化仪的话，直接监测就可以了。
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langlang[使用道具]
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发表于 2013-12-2 00:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢！想问下，我试管离心法纯化蛋白，跑胶，发现几乎没有任何带，这会是什么原因呢？会不会是我表达的蛋白不对啊！
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婴儿脸[使用道具]
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发表于 2013-12-2 00:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可能的原因是你虽然上清有目的蛋白，但量还是少，毕竟离心纯化蛋白，上样量不多，回收效率不高。
按照通常的情况，大肠杆菌表达的蛋白可以形成包涵体，并有少量存在于包涵体外，也就是在菌体内可溶。包涵体是由于过多的大肠杆菌不需要的蛋白表达，从而受到大肠杆菌的主动干预，将这些其自身非必须的蛋白局限，从而形成包涵体。当然，有少部分未被局限，因而未形成包涵体，从而游离在细菌体内。

若破碎细菌后，虽然可在上清中获得少量目的蛋白，但毕竟量少，用处不大。
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yes4[使用道具]
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发表于 2013-12-2 00:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
挂完目的蛋白后，取一点Beads做电泳，没有目的条带就说明没有挂上，基本说明目的蛋白不可溶或者复性不完全。
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发表于 2013-12-2 00:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
包涵体纯化对制备多抗还是很有做的价值的：）
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