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标题:【求助】原核表达为何换了培养基就不行了

雪花子[使用道具]
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【求助】原核表达为何换了培养基就不行了

做原核表达有半年的时间了,我表达的蛋白是一种毒性蛋白,分子量较小,10K以下。刚开始一是非常的不顺利,后来通过摸索终于可以在LB培养基中获得了较高的表达水平,通过包涵体洗涤、纯化和复性,最终得到了具有活性的蛋白。

最近想去做这种蛋白的空间结构方面的实验,咨询了一下。说要在M9培养基中进行诱导表达,因为要对氮元素进行标记,才能去核磁共振测定其结构。但是问题出来了,自从换了M9培养基,我的蛋白就表达不出来了,所有的条件与LB培养基时都是一样的。

请求园子里的各位高手予以帮助,或者有懂测空间结构的园友提出改进的建议。

对了,我的表达载体是PET21,表达菌是BL21 (DE3)plySs.

谢谢大家!
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jiushikeshui371[使用道具]
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回复 #1 雪花子 的帖子

a lot of media are commercially available. 13C, 15N, 13C/15N, ( google them )

try several of these media, not all proteins are expressed efficiently in every medium so this step can be critical to optimize the level of expression.

some other information
cuturl('http://www.protein-nmr.org.uk/labelling.html')
cuturl('http://www.promega.com/pnotes/98/15963_06/15963_06.pdf')
cuturl('http://www.silantes.com/media_powder.pdf')
cuturl('http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/docs/Aldrich/General_Information/1/isogro-as-media-supplement.Par.0001.File.tmp/isogro-as-media-supplement.pdf')
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12xunmei[使用道具]
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10k一下的小蛋白不好表达,在LB里能表达,可能你是融合的。

换了M9表达量下降是正常的,这个培养基本来营养就有限,可能还要再优化一下配方。
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雪花子[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 12xunmei 于 2013-12-2 00:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
10k一下的小蛋白不好表达,在LB里能表达,可能你是融合的。

换了M9表达量下降是正常的,这个培养基本来营养就有限,可能还要再优化一下配方。

我只融合了6个组氨酸标签就可以在LB中表达了,当然也是千辛万苦才搞定的。

你提到的优化配方,从哪方面着手呢?由于要对N进行标记,因此我想不能引入其他含N的物质了吧?我也不是很懂,恳求你赐教啊!
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feima+[使用道具]
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我也出现过类似的情况,用LB表达很好,但是包涵体,为了得到可溶性的蛋白,听从别人的建议,换SOLU BL21菌株,用M9培养基,结果没晕死。细胞长得特别慢,而且压根不表达,费了两个礼拜的时间什么也没得到。

楼主要进行N标记吗?标记量是多大?培养基中N素是必需元素,不要因为N素标记不加其他N源而造成N缺乏。
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我也出现过类似的情况,用LB表达很好,但是包涵体,为了得到可溶性的蛋白,听从别人的建议,换SOLU BL21菌株,用M9培养基,结果没晕死。细胞长得特别慢,而且压根不表达,费了两个礼拜的时间什么也没得到。

楼主要进行N标记吗?标记量是多大?培养基中N素是必需元素,不要因为N素标记不加其他N源而造成N缺乏。

其实包涵体并不可怕的,完全可以通过复性获得较多量的活性蛋白,我的蛋白带4对二硫键,但是复性的很好。

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我是要去测定其空间结构,对这方面也不是很懂,问了一下说是要在M9培养基中表达,才能进行N同位素标记,可是换了M9表达量非常不稳定,而且有时压根不表达。现在就是在这地方卡壳了。

上面的园友提到去买现成的标记好的培养基,但是我查了一下价格相当的贵。
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雪花子[使用道具]
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10k一下的小蛋白不好表达,在LB里能表达,可能你是融合的。

换了M9表达量下降是正常的,这个培养基本来营养就有限,可能还要再优化一下配方。

======================================================================================================

我只融合了6个组氨酸标签就可以在LB中表达了,当然也是千辛万苦才搞定的。

你提到的优化配方,从哪方面着手呢?由于要对N进行标记,因此我想不能引入其他含N的物质了吧?我也不是很懂,恳求你赐教啊!
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njkph[使用道具]
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我做M9培养基有一段时间了,觉得表达跟LB差不多,都挺好的,你要不试试在表达筛选上下点功夫,用M9的平板转化,M9筛选。多筛几个,可能会有结果。要是还有问题,Email联系,我有时间可以帮你试试。
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