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标题:【求助】用过PET32a的大侠请进

prettygirl@[使用道具]
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【求助】用过PET32a的大侠请进


本人最近将目的基因连入PET32a,测序正确、阅读框无误,但是诱导和未诱导的细菌没有差别(sds-page电泳)。后来我把空载体转化后诱导,应该有自身蛋白trx表达(约十几kd),但诱导及未诱导也没发现差别。焦急中,请指教。
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yjf1026[使用道具]
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诱导有问题。原因可能有:宿主菌是否含有DE3,IPTG是否失效?浓度一般来说0.1-1.0均可。
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prettygirl@[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 yjf1026 于 2013-12-2 16:40 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

诱导有问题。原因可能有:宿主菌是否含有DE3,IPTG是否失效?浓度一般来说0.1-1.0均可。

宿主含有DE3,IPTG刚买的,不知大侠诱导如何,空载体诱导未诱导对比明星吗?
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yjf1026[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 prettygirl@ 于 2013-12-2 16:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


宿主含有DE3,IPTG刚买的,不知大侠诱导如何,空载体诱导未诱导对比明星吗?

很明显的!
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remonte[使用道具]
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我也在做pET的原核表达,问你一下,你的空载体的表达量如何?(应该是在18KD左右大小很明显的一条带),看你的意思好像也不确定空载体是否真的有表达啊,如果不确定就是诱导有问题。
IPTG浓度其实对诱导影响不大的,根据我的经验,诱导时菌液的OD值最好还是0.5~0.7为好,只要你的蛋白能够被大肠杆菌忍受得了,就一定会表达的,good luck!
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prettygirl@[使用道具]
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你好,你是用pet32a吗?IPTG浓度多少?诱导几个小时?温度多少?诱导前后对比很明星吗?还有宿主菌用的什么?我的是BL21(DE3)plys.谢谢.请回复,着急啊
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看来将目的片断连接到表达载体中,测序酶切都是正确的,然后表达不出来的人还真的不少。我也是其中的一员。而且我用同一个基因在细胞中转染就已经表达。后来我诱导过夜(其实是我晚上不想去实验室收样品),第二天检测结果出来了,我也不知道到底是不是因为诱导时间的问题。不过我刚刚在核算板块看见一个帖子,他诱导3,6小时都没蛋白表达,也是诱导24小时才有蛋白表达,所以我想我和他的情况差不多。
这是帖子的连接:
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=3350463&sty=1&tpg=2&age=0')
他这样描述的:这几天我自己诱导表达一个蛋白,同样分别在37度,28度进行诱导,IPTG浓度0.1M,诱导3、6小时均没有目的蛋白,后来我们将诱导时间延至24小时,37度下诱导表达成功(低温诱导没有再做)。
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3648755[使用道具]
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我觉得大家在一起讨论还是很有收获的,因为大家都遇到过很多不同的情况。我同学在表达一个蛋白的时候,也碰到过 一种情况,在PKG载体中不表达,有人分析说是不是稀有密码子的问题或者是基因本身就不表达。她很固执,于是将基因重新构建到PET32a载体中,结果表达量还很大的。也不知道哪位大侠碰到过这种情况没有。
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ending[使用道具]
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急死了,怎么愣是诱导不出来.空载体也没有诱导出来.pet32a到底用什么宿主菌?
哪位指导一下,有图片最好
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finger[使用道具]
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用DE3的就可以了。
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