生物实验技术

　　兔抗人IgG免疫血清的制备方法

　　免疫血清的制备是一项常用的免疫学实验技术。高效价、高特异性的免疫血清可作为免疫学诊断的试剂(如用于制备免疫标记抗体等)，也可供特异性免疫治疗用。由于抗原分子表面的不同决定簇为不同特异性的B细胞克隆所识别，因此由某一抗原刺激机体后产生的抗体，实际上为针对该抗原分子表面不同决定簇的抗体混合物 (即多克隆抗体)。另外，抗体的产生具有回忆应答的规律性，这是由于记忆性B细胞参与再次应答所致。

　　一、材料

　　(一)　动物：健康成年家兔，雄性，体重2～3公斤。

　　(二)　器材：剪刀、镊子、注射器(2ml、50ml)附针头(9号、6号)、称量瓶(10ml)、量筒、动物固定架、灭菌三角烧瓶(200ml)、手术器械一套、血管夹、黑丝线、塑料放血管等。

　　(三)　试剂

　　1.　灭菌生理盐水;

　　2.　纯化人IgG(10mg/ml);

　　3.　消毒酒精及碘酒;

　　4.　羊毛脂;

　　5.　石蜡油;

　　6.　活卡价苗(BCG)(75mg/ml);

　　7.　弗氏不完全佐剂(FIA)制备：称羊毛脂10克，逐滴加入优质石蜡油40ml，边滴边研磨，分装于疫苗瓶中(每瓶10ml)，高压灭菌后保存备用。

　　8.　弗氏完全佐剂乳化抗原(FCA-IgG)的制备：将FIA置于60℃30分钟，吸取3ml于研钵中，逐滴加入活 BCG(75mg/ml)0.5ml及纯化人IgG2.5ml,研磨直至形成均一性的乳状液，取1滴滴于冷水面上不散开为合格。

　　二、免疫方法

　　1.　用剪刀剪去家兔两后脚掌的部分兔毛，以酒精及碘酒消毒皮肤;

　　2.　第一次免疫: 用2ml注射器吸取弗氏完全佐剂(FCA)乳化的抗原液1ml，每侧脚掌皮下各注入0.5ml。

　　3.　第二次免疫：间隔10-14天后，于两侧 窝及鼠蹊部肿大的淋巴结内注入FCA-IgG，每个淋巴结注0.1ml，其余注入淋巴结附近皮下共1ml。如淋巴结未肿大或肿大不明显时，直接注入两侧　窝及鼠蹊部皮下。

　　4.　间隔7-10天后，从耳静脉采血0.5～1.0ml，分离血清，以双相琼脂扩散试验测定免疫血清的抗体效价(即试血)。效价至少应达到1∶16 以上时才能放血。

　　5.　若效价未达到要求，可用不加佐剂的抗原液(人IgG)耳静脉内注射免疫。即于1周内注射3次，分别为0.1、0.3、0.5ml。间隔1周再试血。如效价达到要求应立即放血。另外,也可在第2次免疫后，以弗氏不完全佐剂(FIA)乳化的抗原(人IgG)(简称FIA-IgG)再免疫1-2次。注射部位、剂量和间隔均同第2次，再试血测抗体效价，如效价达到要求立即放血。

　　三、放血

　　(一)　心脏采用血法

　　1.　家兔仰面，四肢缚于动物固定架上(或由助手抓住四肢固定);

　　2.　剪去左胸部兔毛，消毒皮肤;

　　3.　用左姆指摸到胸骨剑突处，食指及中指放在右胸处轻轻向左推心脏，并使心脏固

　　定于左胸侧位置。然后，以左拇指触摸心脏搏动最强的部位;

　　4.　用50ml注射器(连接16号针头)，倾针45°角度，对准心搏最强处刺入心脏抽血致死;

　　5.　将抽取的血液立即注入无菌三角烧瓶中，待凝固后分离血清。

　　(二)　颈动脉放血法

　　1.　家兔仰卧同上固定。头部略放低以暴露颈部。剃毛及消毒皮肤;

　　2.　沿颈部中线切开皮肤约10cm，分离皮下组织，直至暴露出气管两侧的胸锁乳突肌;

　　3.　分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织，暴露出颈总动脉后使之游离;

　　4.　于动脉下套入两根黑丝线，分别置于远心及近心端。结扎远心端的丝线。近心端的动脉用血管夹夹住;

　　5.　用尖头小剪刀在两根丝线间的动脉璧上剪一小口，插入塑料放血管。再将近心端的丝线结扎固定于放血管上，以防放血管滑脱;

　　6.　松开血管夹，使血液流入灭菌三角烧瓶中。一般一只家兔可放血80～100ml。

　　四、分离血清

　　将三角烧瓶的血置37℃温箱1小时，再置4℃冰箱内3～4小时。待血液凝固血块收缩后，用毛细滴管吸取血清。于3000rpm离心15分钟，取上清加入防腐剂(0.01%硫柳汞或0.02%叠氮钠)，分装后置4℃冰箱中保存备用。

　　五、结果鉴定

　　以双相琼脂扩散试验测定所获免疫血清的抗体效价，并用琼指免疫电泳鉴定免疫血清中抗体的质量，应产生单一的沉淀弧线。

　　本人接触的该方面的实际操作比较少，该资料是以前查资料时遇到的，有不妥之处，望各位达人指正;引用的的虫友希望能够甄别使用，谢谢!!

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