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标题:【求助】请大家帮忙看下我的2D图都存在哪些问题?

杨过爱大米[使用道具]
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【求助】请大家帮忙看下我的2D图都存在哪些问题?

请大家帮忙看下我的2D图都存在哪些问题?
样品:组织蛋白,采用研磨后超声波破碎,低温高速离心后取上清。
IEF:使用GE 24cm 线性胶条,上样前样品先经TCA-丙酮沉淀,聚焦程序为:
50V 12h
500V 30min
1000V 30min
2000V 30min
4000V 30min
8000V 30min
10000V 3h
10000V 65000hrs
500V 10h
2向使用5%浓缩胶封胶,以低电压过夜电泳,胶体染色法染色。
请大家帮忙看看,提出改进意见,谢谢!


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杨过爱大米[使用道具]
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另外请教大家,就这张图来看,如果换成GE 11cm pH3-10 非线性胶条,蛋白点可否分开?与伯乐17cm pH3-10 非线性胶条相比,哪个更合适?

该实验接下来要做Western blot,这样来说上述两种胶条哪种更好?谢谢!
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你的实验总体来说应该这样改进:样品除盐(可考虑clean up);降低上样量,250-300ug;换成4-7胶条;银染;用低熔点琼脂糖封胶。二向可能还有点别的问题(比如说平衡,这个有点微妙),先把上面提到的问题改了再看。
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杨过爱大米[使用道具]
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我的样品在上样前已经TCA-丙酮沉淀处理,只是所用试剂均为国产分析纯;由于没有测定蛋白浓度,上样量确实过大,这个稍后会做调整;如果改为非线性17cm胶体会怎样?碱性端蛋白不多但存在,我们的目的是要所有蛋白;请问琼脂糖封胶液和浓缩胶区别很大吗?最先也是用琼脂糖封胶,但总是气泡还没完全赶出就凝了,每次都费很长时间,也是在园子里看到园友用浓缩胶的,所以就换了。IEF结束后经两次平衡,10ml+0.2g DTT,15min,10ml+0.25g 碘乙酰胺,15min,后经电泳缓冲液漂洗后转至PAGE胶上。
再次深深感谢!
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针对你上面的问题,建议如下:我们做双向电泳有一套标准化程序,所以没试过浓缩胶,低熔点琼脂糖不是很容易凝的,操作熟练不会出现你说的气泡没赶出就凝的现象;重要步骤我们也不用国产试剂,这个是很重要的,你以为用国产试剂省钱,实际上你用国产试剂做失败了,重复多次浪费的钱更多!选择3-10的胶条不是不行,但是这里面有两个问题可以探讨(不是原则):一个是我们做双向电泳的目的是什么?是为了得到有意义的信息,也就是准确可靠的差异点,而并非要胶跑的漂亮,也不是要跑出来的点越多越好。我们常说哪怕你胶跑得再烂,只要你从中找出一个有意义的蛋白,就足够了。另外,我们的经验是3-10 的胶条跑出来的点比较集中,实际上很多点分得不清楚,如果改成4-7的胶条(你这个碱性端的点其实真不多),那么你会发现可能你能得到更多的点,图更加漂亮。之所以建议你用4-7的胶条,其中一个愿意也是从你的角度考虑,你希望得到漂亮的图。转二向,你的条件估计没什么问题,这是常规,但是手法就需要练了。
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杨过爱大米[使用道具]
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非常感谢!
最近买了一包伯乐的胶条,17cm,非线性,蛋白先经TCA-丙酮沉淀,聚焦程序同上,二向采用横流电泳,胶体染色法染色,结果如下,请前辈们给出改进意见,谢谢!
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flower-201[使用道具]
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你的图整体上看上去不干净,请问你做的是什么组织,我跑的是肺组织。
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杨过爱大米[使用道具]
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回复 #8 flower-201 的帖子

我在灌胶时两端漏胶了,我觉得左面那些纹纹应该是漏胶导致的,还有就是脱色时间短,主要问题大分子量的蛋白条纹太多,没有分开,总是这样,很苦恼啊!
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flower-201[使用道具]
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请问一下,你的mark是怎么上样跑的啊?我的mark总是跑得不好,郁闷~
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