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标题:【求助】无奈的SDS-PAGE问题

吉吉0120[使用道具]
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【求助】无奈的SDS-PAGE问题

最近一年来只要跑胶就有如图的问题,图是网上搜来的,我的问题和该图一模一样(第6道渗下去的问题),所以就没照相。 望遇到过同样问题并顺利解决的各位不吝指教!我快要疯了,目前实验主要是western,出这种问题非常痛苦!想了很多方法也没有解决。


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2013-12-4 22:01
71914475.jpg (36.05 KB)
 
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吉吉0120[使用道具]
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顺便提一下,是第六道像漏下去这种现象
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jiushikeshui371[使用道具]
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看图后有以下意见:
1 第6道加样时可能是加样器尖部刺穿了胶底部,所以漏了。
2 蛋白样品没有和上样缓冲液充分混合。
3 制胶时,要充分混匀,使得胶的质地均匀。
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补充一下玻璃板检查下有没有问题,还有就是配胶我们实验室都是用的超纯水
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cwcwcww[使用道具]
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我们也经常碰到,这也是我最苦恼的问题,如果重要的实验遇见这种漏样的状况,我就直接卸胶不要了。

我自己认为是上层胶和板子之间贴的不紧,只要一加电压,样就进到缝隙里了。为什么会这样我也一直搞不清楚。

一般配胶时,我会挑磨损比较小的板子,洗的干干净净,配胶后放冰箱,第二天用小一点的电压跑上层胶。但这种现象的几率只是减少,仍会发生。

希望听到大家的建议。
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cwcwcww[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 吉吉0120 于 2013-12-4 22:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
最近一年来只要跑胶就有如图的问题,图是网上搜来的,我的问题和该图一模一样(第6道渗下去的问题),所以就没照相。 望遇到过同样问题并顺利解决的各位不吝指教!我快要疯了,目前实验主要是western,出这种问题非常痛苦!想了很多方 ...

我们用蒸馏水。
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吉吉0120[使用道具]
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由于我们的水是自来水直接处理后去离子的,现用现取的,不像蒸馏水毕竟是高温加工过的,还有很多去离子水也是用蒸馏水再加工的,会不会上述现象跟没有脱气有关呢?
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小螺号[使用道具]
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与水的关系不大。
主要是制胶的问题。
近一年都出现这样的问题?
你总共做了几次?每次使用的胶是怎么配的?配方是什么?放置了多长时间呢?
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douding66[使用道具]
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很简单的问题,原因也很简单,做胶的时候不注意细节。
这种情况一般出现在拔底面spacer(大板胶通常有底部的封条)和样孔梳子的时候。
原因有四种可能:
1. 梳子过紧。梳子或底边spacer的宽度和两边spacer的宽度有极细微的差别(质量不合格或不配套),使得勉强用力拔梳子的过程中,造成玻板的错动。通常除梳孔漏样外,玻板底部往上会出现局部的气泡。
2. 制胶时间过长或者制好后长时间不用却未采取保湿的措施。实际上这两者仍然造成问题1的麻烦,拔梳子时连带错动玻板。
3. 进样的时候,加样枪头深入加样孔过深从而挤开玻板,造成微小错动。采用拉长的进样枪头,同时仍要注意不能插入过深。
4. 玻板质量勉强合格。国产玻板不能做到非常光滑,使得稍微用力玻板就会松脱,产生错动。
与胶体是否混匀无关,与水质无关(一定要用DDW,这是毫无疑问,不必经常提及的最基本的注意事项),与玻板是否洗净或磨损无关(与梳子是否磨损有点关,因为塑料制品磨损后不一定变薄,经常会边缘起皱增粗;同样使得本来一致的间距,由于梳子增粗,拔出阻力增大,极易造成微小错动)
就本图而言,实验者最主要的弊病在于加样枪头过分深入,原因是中间孔道漏样,即非常可能就是加第6道时过分用力。若漏样出现在两侧,则主要问题在于拔梳子时的错动。
不可能是加样器刺穿底部(假设加样器尖端比spacer间距小),如果是刺穿不会出现在堆积胶和分离胶分界位置一条线的漏样,而只会是一个点的汇集(刺穿点);因此如果是刺穿,更核心的问题是刺穿的同时枪头将玻板挤开,造成微小错动。
因此,如果你总是出现类似问题,请注意你每个实验细节。
不要让胶干掉,凝固后尽量立即使用;即使不立即使用,请先拔去梳子和底部spacer,然后注意保湿。
拔梳子请在液体中操作。
加样时用拉长且更细的进样枪头;没有条件,也不要拼命拿枪头往下挤。
凌晨3点了,不打了。。。。。。呼呼
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吉吉0120[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 小螺号 于 2013-12-4 22:05 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

与水的关系不大。
主要是制胶的问题。
近一年都出现这样的问题?
你总共做了几次?每次使用的胶是怎么配的?配方是什么?放置了多长时间呢?

原来我们用的配方是优化过的,后来怀疑是不是配方问题,就用的bio-rad的推荐
配方。基本上两三天得做上几块胶,所以感觉配角就像撞运气。
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