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标题:【求助】p-Akt压片曝光后为什么是这样的？

qqshepherd[使用道具]
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发表于 2013-12-5 16:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】p-Akt压片曝光后为什么是这样的？


最近在做p-Akt的WB，简要步骤如下：用细胞提的蛋白，裂解液RIPA（中），蛋白上样量30ug，丽春红染膜后膜上有蛋白条带，5%BSA室温封闭2h，一抗稀释度1：2000（说明书），用1%BSA的TBST配的，4度过夜，二抗稀释度1：4000，同样是用1%BSA的TBST配的，室温1h，然后曝光。洗膜7min*5次，Tween-20含量0.1%。但不知道结果为什么是这样的，感觉背景深，非特异条带多，尤其是最下面那条（目的条带为上面一条较深的），不知大家有什么建议？


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2013-12-5 16:18
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xyw5[使用道具]
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发表于 2013-12-5 16:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 qqshepherd 于 2013-12-5 16:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

最近在做p-Akt的WB，简要步骤如下：用细胞提的蛋白，裂解液RIPA（中），蛋白上样量30ug，丽春红染膜后膜上有蛋白条带，5%BSA室温封闭2h，一抗稀释度1：2000（说明书），用1%BSA的TBST配的，4度过夜，二抗稀释度1：4000，同样是用1%BSA的TBST配的，室温1h ...

加大稀释度
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eric930[使用道具]
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发表于 2013-12-5 16:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 xyw5 于 2013-12-5 16:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')



加大稀释度

加大抗体稀释度，背景是可能会好些；但是有特异条带信号减弱的风险。你应该上调BSA的浓度到5%，可以参考我写的《WB实战指南》抗体孵育章节，尤其考虑到BSA的信价比。
从经验上判断，可能即使你换用了gelatin做封闭剂，底边的那条信号应该还是很浓，不过并不影响结果，不需要考虑
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qqshepherd[使用道具]
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发表于 2013-12-5 16:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
初步怀疑也是抗体稀释度的问题，是把一抗和二抗的稀释度都加大吗？同样也想到了加大稀释度，特异性条带信号会减弱的风险，所以还是比较难把握。
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ritou1985[使用道具]
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发表于 2013-12-5 16:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

这个图可能是你的一抗特异性太差了的关系吧,如果可以的话考虑换个其他公司的抗体试试.
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toy[使用道具]
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发表于 2013-12-5 16:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可以增大抗体的稀释度试试！
既然你订购是4060，为什么不按照说明书的建议来稀释抗体呢？
IMPORTANT: For western blots, incubate membrane with diluted antibody in 5% w/v BSA, 1X TBS, 0.1% Tween-20 at 4°C with gentle shaking, overnight.
从远处来看你这张图，倒不是非特异性条带多，而特别像一张考染的page胶，好像所有的条带信号都出来了，更像是封闭的问题了！
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发表于 2013-12-5 16:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我最近刚做的p-Akt，情况一样，不影响结果，可能和抗体的特异性有关，可以换换抗体试试，多抗在特异性上不如单抗
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qqshepherd[使用道具]
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发表于 2013-12-5 16:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
非常感谢你的建议！
我们一抗稀释度就是根据说明书来的，1：2000，但BSA浓度是1%，下次在做可能要用5%了，看看行不行。因为是磷酸化蛋白，所以就没用脱脂奶粉，因为因为脱脂奶粉中含有酪蛋白，会出现高背景，但它的封闭效果应该比BSA好，也试一下吧，我觉得现在背景倒是还可以。
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qqshepherd[使用道具]
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 小中大
我们买的抗体就是单抗，不知你用的是哪家公司的抗体？
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小游abc[使用道具]
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 小中大

请问楼上做p-AKT是用来反映PI3K的活性吗？我最近要做这方面的，不知道反映PI3K活性的指标应该检测AKT的磷酸化还是非磷酸化，楼上可否指点一二？谢谢！
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