蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】诱导出蛋白没？

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 12  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】诱导出蛋白没？

rxcc33[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79965
精华 0
积分 633
帖子 885
信誉分 100
可用分 5303
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-18
状态 离线
1

发表于 2013-12-6 14:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】诱导出蛋白没？

直接上图，

bbcodeurl('C:\Documents and Settings\Administrator\桌面\yyyyyyyyyyyyyyyyy.bmp', '%s')

1 - 0 h 取样 (取样均取1.5ml)

2 - 1 h 诱导 （加1mM IPTG）

3 - 1 h 未诱导（加0.5%glu）

4 - 2 h 诱导

5 - 2 h 未诱导（加0.5%glu）

6 - 4 h 诱导

7 - 4 h 未诱导（加0.5%glu）

8 - 6 h 诱导

9 - 6 h 未诱导（加0.5%glu）

表达的蛋白在37KD左右，红圈圈起来的可能是诱导出来的，大家看看是不是？

还有一个问题，溴酚蓝差不多是0.6Kd吧，为什么溴酚蓝总是跑得MAKER还快呢，MAKER只能看到四条带，说明其它三条带都跑没了，为什么出现这种情况呢？？？

谢谢各位了！


查看积分策略说明
附件
2013-12-6 14:59
49924555.jpg (12.97 KB)
 
顶部
xyw5[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75137
精华 1
积分 620
帖子 815
信誉分 102
可用分 4991
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
2

发表于 2013-12-6 14:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

至于这个蛋白是不是你的目的蛋白，最好做个WESTEN进一步鉴定啦，我看红色框框下面那个带表达蛮浓的嘛。为嘛不弄个空载诱导做对照呢？建议加上再跑跑看对比。至于为什么溴酚蓝比MARKER跑得快，首先纠正一下，溴酚蓝在不同浓度的PAGE中指示不同大小的蛋白条带，不是你所指的0.6KD。至于你的蛋白胶：一，胶的浓度。提高胶浓度。二，缓冲液的正确配置。希望对你有帮助！
顶部
gogo[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77052
精华 0
积分 821
帖子 1341
信誉分 100
可用分 7487
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-12
状态 离线
3

发表于 2013-12-6 15:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

根据marker大小判断，红圈下面的是你的诱导带。表达量不是特别高，但也还可以了。37kd的蛋白用12%的SDS-PAGE比较合适。再有，下次marker点左边，看着舒服些。
顶部
rxcc33[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79965
精华 0
积分 633
帖子 885
信誉分 100
可用分 5303
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-18
状态 离线
4

发表于 2013-12-6 15:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
红色框框中的条带为什么在未诱导中没有表达呢，而红色框框下面的条带在未诱导有表达呢？难道是本底表达？

我用的是12%的胶，配方是宝生物公司上抄来的，可以吗？溴酚蓝在12%的胶中表示多大的片段呢？

空载体是把目的基因直接切了，还是构建另一个表达蛋白的基因上去呢，比如GST蛋白？
顶部
fei1226com[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79957
精华 0
积分 599
帖子 898
信誉分 100
可用分 5286
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-18
状态 离线
5

发表于 2013-12-6 15:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1，本底表达或者是菌体本身就有相应大小的条带，你不用太计较这个，反正你主要是要看你蛋白的表达。

2，园子里以前有人提问过这样的问题，你可以看看cuturl('http://atgc.dxy.cn/bbs/topic/2247572')

3，12%的胶完全可以观测你的目的条带嘛，可以用的。如果你一直纠结MARKER的显示可以提高到15%的PAGE，这样的话，你的蛋白应该也比较

靠中。仅供参考，实验才能说明问题。

4，空载就是空载，没有必要花精力再去构建一个对照基因，能够说明问题就可以了！
顶部
rxcc33[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79965
精华 0
积分 633
帖子 885
信誉分 100
可用分 5303
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-18
状态 离线
6

发表于 2013-12-6 15:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的载体上是T7启动子，本底表达会相对多一点，你说的很对，要做个空载，
顶部
rxcc33[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79965
精华 0
积分 633
帖子 885
信誉分 100
可用分 5303
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-18
状态 离线
7

发表于 2013-12-6 15:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还有，如果菌体本身就有相应大小的条带的话，空载诱导也会有条带，这样只有后序做WESTHERN验证了
顶部
vcve[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76131
精华 0
积分 743
帖子 1043
信誉分 101
可用分 6126
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
8

发表于 2013-12-6 15:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用12%的胶跑mini-VE可以看见19KD的带，甚至15kD。如果你的也是mini-VE的话，若你的marker正确，你的胶浓度应该在8-10%。还是再仔细确认一下。
顶部
rxcc33[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79965
精华 0
积分 633
帖子 885
信誉分 100
可用分 5303
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-18
状态 离线
9

发表于 2013-12-6 15:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 vcve 于 2013-12-6 15:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我用12%的胶跑mini-VE可以看见19KD的带，甚至15kD。如果你的也是mini-VE的话，若你的marker正确，你的胶浓度应该在8-10%。还是再仔细确认一下。

谢谢你的回复，我每次做的时候有个习惯，就是分离胶做过后加ddH2O压平胶面，ddH2O漫过最低的玻璃板，不知这样ddH2O会不会稀释分离胶的浓度？？

我的浓缩胶长度很短，7cm的玻璃板浓缩长度大概在8mm，浓缩胶分离胶都用120V的电压跑，不知这样影响大不大？
顶部
qqq111[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73201
精华 0
积分 830
帖子 1238
信誉分 101
可用分 7086
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-20
状态 离线
10

发表于 2013-12-6 15:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

灌完分离胶我也是加DDW压胶隔氧，经常觉得分离胶凝好后水层比凝前要高，即凝胶过程中水分析出，这也是严谨的人用水饱和正丁醇压胶的原因。所以用水压胶不会稀释分离胶的浓度，倒是会提高（轻微的）分离胶的浓度。

电压影响不大。我一般用80V半小时，然后100-120跑完，总共2-2.5小时。

我最近一直在跑12%的胶，用30%的丙烯酰胺-甲叉丙烯酰胺储备液，GE的mini-VE，浓缩胶2-8mm，肯定可以看到19kD的marker带，有时会看见15kD的带。35kD位置肯定不是那么靠下的位置。

而且看你溴酚蓝前沿很粗，显然是胶浓度低小分子量蛋白没分开。还是确定一下丙烯酰胺stock的浓度吧。

另外，不知你stock的交联度多大？这个很关键。怀疑也有可能是交联度太小。
顶部
 12  1/2 12››