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标题:【求助】western blot三个月了，一直是目的蛋白还可以...

wsll[使用道具]
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发表于 2013-12-6 15:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】western blot三个月了，一直是目的蛋白还可以...


我从今年10月份开始做western，可一直没出来什么实质性的结果。内参总是不好。
现在有几个问题想请教一下各位：
昨天做的时候，发现电泳的速度特别慢。我用的是15%的分离胶，5%的基层胶。我用的是BIORAD的垂直电泳装置。梳齿底部到两胶分界处的距离大概有1.5cm，电泳了70分钟才到交界处。后来我换了一下外槽的电泳液，，跑分离胶的时候快了一些。我使用60V恒压跑积层胶，90V跑分离胶。这样可以吗？
电泳速度慢，主要跟什么有关系呢？
还有很多人在论坛里都说要赶走凝固好的胶的底部的气泡，我们实验室的都没赶过。昨天我也发现胶两块玻璃板的底部是有不少气泡，对电泳速度有什么影响？如果要赶得话，那怎么去赶下边的气泡呢？

我的目的蛋白是12KD的，用的内参是β-actin,转膜的时候用38min可以吗？我们实验室用的是BIORAD的半干转膜仪。
昨天我做的过程中，发现转完膜之后，内参的那条带上的marker还有很多停留在胶上，膜上面倒是也有，只是颜色比较淡。我用的是fermentas的预染彩虹marker。后来想一下，我在转膜前用75%的酒精把赶气泡用的玻璃棒擦了一下，紧接着就用来赶气泡了，乙醇会不会对转膜有影响？
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发表于 2013-12-6 15:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们实验室的设备条件那是没得说，现在试剂也用了不少，可老是没什么实质性的结果，心情很是郁闷！！希望那位老师帮忙指点一下。谢谢~
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hot_hot_hot[使用道具]
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发表于 2013-12-6 15:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是否可换一下条件？

75mA 跑胶，20V转18分钟。

另外，可先做SDS-PAGE.用不同量的样本，考马斯亮蓝染下，看哪个量比较合适。

对于凝固好的胶的底部的气泡，尽量赶走。

WESTERN牵涉环节较多。如无经验，可请师兄师姐先做一遍。
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vivian4123[使用道具]
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发表于 2013-12-6 15:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

浓缩胶1cm就够了，分离胶如果是100V左右的话，每小时能跑2cm，你算下时间看你的是不是慢了。

转膜时间延长到1小时试一下吧，感觉38min有点短。
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发表于 2013-12-6 15:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

转膜时间有点短了，建议一个半小时到两个小时试试
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zhezhe[使用道具]
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发表于 2013-12-6 15:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
其实跑胶底部的气泡一点都不影响，我经常没赶干净，照样跑胶很整齐，WB结果也很好
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发表于 2013-12-6 15:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

内参是β-actin是有的时候不好做，不知道楼主做实验的材料是什么？
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发表于 2013-12-6 15:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
两张图一个是beta-actin,一个是我的目的蛋白。问题有二：1、不知道为什么beta-actin各上样孔之间会连在一起？而同在一块胶上跑出来的目的蛋白就是分开的。我用的是恒压60V跑5%的积层胶，用90V跑12%的分离胶。也注意了在37度约30min促凝后，让胶在室温冷却约40min。我是用的在鼎国昌盛买的5*的SDS上样缓冲液，是把他终体积到1*用的。2、我是同时跑的两块完全一样的胶，两个的加样量完全一致，样品也是相同的，可我的目的蛋白两个做出来结果却不太一致，这是为什么呢？尤其是第一个问题，请哪位高人可以帮忙指点一下。我也问过师姐，她们也不知道原因。
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发表于 2013-12-6 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的材料是人肺腺癌细胞和肺鳞癌细胞系
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 小中大

这次我的上样量是80ug
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