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标题:【求助】蛋白纯化后酶切目标蛋白不见了

junjie05[使用道具]
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发表于 2013-12-6 16:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白纯化后酶切目标蛋白不见了


纯化一个MBP标签融合蛋白，总大小55kd左右，靶标蛋白12kd左右，酶切后酶切比较完全 ，切下的MBP带挺好，但是目标蛋白却没有了 那位前辈帮忙看一下，我对蛋白这方面不太懂，非常感谢。有图在附件。


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2013-12-6 16:07
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89tongzijun[使用道具]
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发表于 2013-12-6 16:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

看起来酶切是比较干净的，Marker 红色的那条是60么？

右边酶切后的电泳条带下方的刚好被 DXY.CN 给遮住了，比较不了。

不过酶切后的样品可有沉淀？

由于目的片段的分子量相对较小，所以酶切后其相对浓度比较低的，建议可以走个柱子看看。
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89tongzijun[使用道具]
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发表于 2013-12-6 16:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

非常感谢您的帮忙

红色的是72 以下的分别是55 43 34 26 17 10

酶切后的没有沉淀

右边泳道最下面10kd左右模模糊糊有点带 也有可能是杂带

您的意思是再过个离子交换柱吗

那个分子筛对我这个 可以尝试下吗
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IAM007[使用道具]
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发表于 2013-12-6 16:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
蛋白量少是不是可以用western检测，分子量太小可以用梯度胶试试
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发表于 2013-12-6 16:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢

我是想把那个小蛋白纯化出来
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remenb[使用道具]
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发表于 2013-12-6 16:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的融合蛋白是带MBP标签的，酶切后再走一个 Amylose 的柱子试试看，

正常的话你想要目的蛋白应该在穿过里
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remenb[使用道具]
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发表于 2013-12-6 16:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这种切割很是烦人，尤其是你的蛋白不是很大的时候。

10k 左右的小蛋白跑胶不容易，但你的marker跑得不错，所以检测方面的问题基本上可以排除。

融合伴侣43k，你的12k，应该是你目标条带1/3到1/4亮度，应该能看到了，而你没看到，说明可能根本就没有在胶上，或者很少在胶上。

融合上MBP水溶性不错的，这个“小蛋白”溶解性如何呢？小量切割，100微升，切割产物全部做电泳样品，溶解了run ran 看，排除靶标蛋白沉淀的可能。

整体上讲，你的切割还是很不错的，下次可以少加点酶，那东东不便宜啊：）
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2013-12-6 16:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼上的：

我们用的TEV酶都是自己表达纯化的，哈哈
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ritou1985[使用道具]
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发表于 2013-12-6 16:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议你跑小分子胶
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lixi559[使用道具]
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发表于 2013-12-6 16:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也遇到这样的问题，用TEV酶切后只能看到halo标签，但目的蛋白23kd看不到，开始认为是被TEV 28kd遮盖了。但用halo填料抓时竟然也看不到目的条带，切下来的是halo（原来是halo结合在柱子上的）。目前不知道怎么变，晕死状。如果有哪位知道原因，告诉小弟，不胜感谢
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