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标题:【求助】利用银染的双向电泳技术能找到信号通路蛋白吗？

zranqi_1[使用道具]
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发表于 2013-12-6 16:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】利用银染的双向电泳技术能找到信号通路蛋白吗？


我的课题是利用双向电泳技术寻找到药物作用的信号通路蛋白。

做了近一年的实验，跑了120块胶，做了近10次 质谱，都未找到一个信号通路的关键蛋白，现在对这个实验技术产生怀疑。
也怀疑是不是药物已经对肿瘤细胞没有什么作用了，至少是低浓度的情况下。
希望同行，给点建议。
我是否应该坚定地做双向电泳？继续这个思路？或者说激酶活性有改变，但是其含量没有什么变化，无法用银染的双向电泳检测出来：

现在很着急，担心博士根本比不了业。

有没有什么染色方法，专门染磷酸化的蛋白？
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greenbee[使用道具]
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发表于 2013-12-6 16:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

首先，做实验刚一年，没结果不用着急，太正常了，现在需要的是心态，放松，然后多想想

思路本身应该没有太大问题，一方面可能是实验条件的问题，一方面是你的经验问题。所以，再做做是正常的。不过还是有些建议如下：
1。可以考虑换换试验手段。比如LC/MS，或者先去除高丰度蛋白等等。
2。也可以换换思路，比如利用已知的众多的信号通路抑制剂、激动剂去和目标药物联合用药，根据结果分析可能的通路。毕竟你的实验目的不是2D本身，而是找到信号通路对吧
3。至于你说的磷酸化也就是功能而不是量的改变是可能性非常大的，不过你现在需要的是普筛，所以抑制剂的方法可能会给你些idea，然后再去检测是量还是功能
4。也许2D或者LC/MS也可以分辨磷酸化改变，但是不熟悉，有知道的介绍下吧~~~
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lxh031[使用道具]
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发表于 2013-12-6 16:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可考虑用磷酸化蛋白富集试剂盒富集磷酸化蛋白，用磷酸化蛋白进行双向电泳试试。
另外还有其他一些标记磷酸化蛋白的方法，然后跑双向电泳，查下文献，很多的。
另外请注意一点是：蛋白的磷酸化水平变化是很快的，可能刺激后几分钟达到高峰，随后就降低了，所以时间点的选择很重要。估计你的实验设计也需要调整。
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hold住[使用道具]
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发表于 2013-12-6 16:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

2D看到且能鉴定的蛋白质大多是中高丰度蛋白质，而很多重要信息调控蛋白质是中低丰度的，由此决定你现在的手段是有问题的，建议改变策略：
1 考虑富集特定修饰蛋白质如磷酸化蛋白质，如前几位所述有很多试剂盒。
2 或者用针对关键通路的蛋白质IP以后，鉴定与通路相关药物刺激后蛋白质变化，该方法最好与稳定同位素代谢标记和LC-MS相结合。

以上两点，都可以保证找到通路相关蛋白质表达变化。
祝好运
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发表于 2013-12-6 16:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

根据以上朋友的建议和我自己的一些想法提出如下方案：
1，特异富集可能的信号通路相关蛋白，比如富集磷酸化蛋白，当然也有可能是其它类型的蛋白，增强信号通路蛋白鉴定的可能性。
2，采用iTRAQ策略进行蛋白质组学研究，与普通双向电泳以及DIGE电泳相比，iTRAQ的优势有两种，一种是定量准确，有实验表明大于5%的差异即可检出并且结果可靠，这样就大大增加结果的可靠性，增加发现信号通路蛋白的可能性，另外由于iTRAQ是色谱和质谱连用的，所有分离出来的蛋白（不管是有差异的还是无差异的）都是有鉴定结果的，这又从另一方面增加发现信号通路蛋白的可能性，
你自己主要的问题就是样品的准备，包括确定取哪个或者哪几个时间点的样，同时采用什么方法富集信号通路相关蛋白。
以上建议仅供参考！
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u76mp[使用道具]
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发表于 2013-12-6 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

同意楼上的观点，银染灵敏度低，线性范围窄。试试用DIGE技术，2-D分离看看
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发表于 2013-12-6 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有专门针对磷酸化蛋白的染料可以显示磷酸化蛋白的变化量，我之前就做过，染色的效果也还可以，不过如果可以先针对磷酸化蛋白进行富集之后再检测当然更好。
我个人认为你可以先查找一下文献看看究竟你要找的蛋白是可以通过刺激之后产生磷酸化的改变，确定好实验的刺激条件之后再进行实验比较有目的。这样可以选择的实验条件以及方法都可以有所指。
个人研究生的时候跑过磷酸化蛋白的2D-gel，觉得2D这个技术受影响的方面太多，你能跑了120多张胶，真佩服佩服！
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发表于 2013-12-6 17:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不同意楼上的部分观点，DIGE有其优点，但并不表现在实际灵敏度高，对应用来说。同样的样品，用DIGE你能找出来的点不一定比用银染多。
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发表于 2013-12-6 17:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是否可以把这个药物连接到固相介质，蛋白溶液与之孵育，洗涤洗脱后，看是否具有特异结合的靶蛋白，再根据这个找相关的信号通路蛋白
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zranqi_1[使用道具]
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发表于 2013-12-6 17:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 seven7 于 2013-12-6 17:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

是否可以把这个药物连接到固相介质，蛋白溶液与之孵育，洗涤洗脱后，看是否具有特异结合的靶蛋白，再根据这个找相关的信号通路蛋白

我的药物是天然产物，分子量只有几百Da。开始我们考虑过，你这个想法，后来老板就否定了。理由：首先要将药物与一个接头连接，然后将接头连接到固相基质上。这个操作相当难。纯粹搞化学的人也不一定能能完成这两个反应，再者，利用ITRAQ 技术洗脱下来的有很多是非特异性的结合的蛋白。
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