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标题:【求助】 继续求助：蛋白纯化峰分不开

mogu[使用道具]
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发表于 2013-12-6 17:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】 继续求助：蛋白纯化峰分不开


纯化菜鸟级人物求助：曾经在院里求助过类似问题（cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=15347087&sty=1')），根据战友的建议采用了柱体积较大的Q Sephorose HP，同时延长了洗脱时间，分辨率有一定的改善，但目的蛋白峰与其他蛋白峰仍不能很好的分离，且蛋白稀释较大，收集时在很多管中均检测出目的蛋白，还请各位多多指教！

蛋白性质：pI 未知；分子量，约80 kDa; 在中性碱性条件下稳定；来源：真菌发酵

纯化系统：AKTA

实验1：
纯化条件：
Column: Q Sephorose HP （柱体积：约28 ml)
Sample: 2 ml (0.53 mg/ml)
Loading buffer: 0.025 M Tris-HCl buffer，pH 8.5 (用填料做预实验时，目的蛋白在pH 8.5时才能被吸附)(1 ml/min)
Eluting buffer: 0.025 M Tris-HCl,pH 8.5, containing 1 M NaCl (2 ml/min)
Gradient elution: 150 min, 100%
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 小中大
试一下，直接显示图片


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 小中大

呵呵，谢谢，我也想把图直接展开呢，捣鼓了半天没搞定
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发表于 2013-12-6 17:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
电泳图：


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 小中大

目的蛋白1浓度比较低，可以检测出蛋白活性，但是跑电泳时不是很清楚，上图是目的蛋白2收集的不同管子中的电泳图，不知道为什么会收集很多管都有目的蛋白，该如何改善呢~
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发表于 2013-12-6 17:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的检测线是A280？最好将A254也加上，说明各条线的含义。再附上SDS-PAGE图。

所写条件有疑问：Column: Q Sephorose HP （柱体积：约28 ml)；Sample: 2 ml (0.53 mg/ml)
28ml的Q柱上样1.06mg的蛋白似乎不合情理。
从图看，蛋白量应该不止1mg。
不知道你是哪个没有讲清楚。

“收集时在很多管中均检测出目的蛋白”，能标明是那些管号？

图示右边如果是电导，蛋白1出峰应该是小于0.1N NaCl的。后期可以考虑整合分段方式。

目的蛋白1和2都是要纯化的蛋白吗？

纯化难以用一次就完成任务，还是要几步来完成的。

建议在完成图示的一步后再来一次Q柱的穿透纯化，设定pH6.5-7。
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发表于 2013-12-6 17:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

实验2：
在出峰处hold了下~

实验条件：
Column: Q Sephorose HP
Sample: 2 ml (0.525 mg/ml)
Loading buffer: 0.025 M Tris-HCl buffer， pH 8.5 (1 ml/min)
Eluting buffer: 0.025 M Tris-HCl, pH 8.5, containing 1 M NaCl (2 ml/min)
Gradient elution: 13.5 min, 9%; 9% for 10 min; 16.5 min, 20%; 20% for 7.5 min; 22.5 min, 35%; 35% for 15 min

纯化图：


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发表于 2013-12-6 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
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发表于 2013-12-6 17:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
其中２０及２１管为目的蛋白１，４２至４８为目的蛋白２；这次同样在很多管中均检测出目的蛋白活性，跑电泳时只选取了活性相对较高的几样
目的蛋白1：19-30管，其中20-22、25-26活性较高；
目的蛋白2：41-60，其中41-50活性均较高；
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发表于 2013-12-6 17:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的检测线是A280？最好将A254也加上，说明各条线的含义。再附上SDS-PAGE图。

所写条件有疑问：Column: Q Sephorose HP （柱体积：约28 ml)；Sample: 2 ml (0.53 mg/ml)
28ml的Q柱上样1.06mg的蛋白似乎不合情理。
从图看，蛋白量应该不止1mg。
不知道你是哪个没有讲清楚。

“收集时在很多管中均检测出目的蛋白”，能标明是那些管号？

图示右边如果是电导，蛋白1出峰应该是小于0.1N NaCl的。后期可以考虑整合分段方式。

目的蛋白1和2都是要纯化的蛋白吗？

纯化难以用一次就完成任务，还是要几步来完成的。

建议在完成图示的一步后再来一次Q柱的穿透纯化，设定pH6.5-7。

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非常感谢！样品上样前采用考马斯亮蓝法（微量）测定样品蛋白浓度为530 μg/ml,上样采用2 ml的上样环，应该没错的啊~

目的蛋白1和目的蛋白2均是我要纯化的蛋白，且两个蛋白性质性质比较相似，分子量均在75-80kDa左右，催化相同底物反应，只有跑非变性电泳时才可以看出两者的区别。

实验1中，目的蛋白1出现在管21-30，其中22-24管活性较高；目的蛋白2出现在管40-55中，其中41-45管活性较高
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