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标题:【求助】载体构建，紧急求助

尘朵朵[使用道具]
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发表于 2013-12-7 16:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】载体构建，紧急求助


最近要构建载体，我是新手，大家帮帮忙啊。
老板让我把5‘非编码区加在目的基因前面，然后在5’UTR和目的基因之间加上flag标签。
我想直接设计一对引物，一次扩出5,UTR和目的基因，然后加在载体上。为了能加上flag，在设计引物的时候，上游引物的5’端加上Flag序列及ATG。这样得到的序列就是：部分5‘UTR+Flag+剩余的5'UTR+目的基因的CDS。各位高手看看，这个思路行吗，如果不行请给个好的建议，谢谢。
还有就是，把CDS里的ATG不删除行吗。
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发表于 2013-12-7 16:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #1 尘朵朵 的帖子

感觉理解有误吧，你老板让你带上5‘UTR，但是并不是要让5’UTR也编码蛋白吧，只是保留该区域可能是想做调控，所以和ATG没有关系，该怎么设计就怎么设计就是了

标签为什么一定要加在前面？可以加到CDS的后面去啊，也就是把终止密码去掉加标签就是了

比如基因是---5’UTR-ATG-CDS-TAA-----
引物序列选择 5‘UTR的起头+TAA之前几个氨基酸开始，不要TAA，改为tag+TAA，结果是
5’UTR-ATG-CDS-tag-TAA

不知道这样是否符合你老板要求，关键是试验目的不清楚，为什么保留UTR（我猜是想做调控）以及tag的位置是否有已知的影响等等，供参考
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发表于 2013-12-7 16:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #1 尘朵朵 的帖子

还有，不知道你的目的基因有多少内含子，CDS包含多少内含子，也就是不知道你的UTR位置，可能会很长，或者CDS不在第一外显子上，那样就需要分别扩增UTR和CDS再连接了
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发表于 2013-12-7 16:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #3 68943512yao 的帖子

非常感谢你的回复。我们加5‘UTR是为了调控用的。我们做过一个不加UTR的蛋白表达非常高，老板说，不行，太高了，细胞失去了原来的生理状态，所以让加上UTR，说这样可以调控在比较低的表达水平。今天他又说把3’UTR也一同加上。根据我们的目的，你能给我再给一些建议吗？对了我们的5'UTR有100bp左右，3‘UTR1000bp左右。如何有效的加flag?谢谢。
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发表于 2013-12-7 16:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #3 68943512yao 的帖子

对了，还有就是UTR需要全扩吗，必须要从第一个碱基设计引物吗，能不能把大部分UTR序列加上就行了。谢谢
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发表于 2013-12-7 16:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

感觉很怪异，信息实在不足没法分析，怎么还会嫌表达量高的？在什么表达体系里？表达的是真核基因还是原核？基因有多少内含子和外显子？

另外你说的5‘UTR是想用mRNA上的？如果就是为了降低表达量为什么不用启动子？你用的什么表达载体？上面是什么启动子？换成个弱启动子甚至可诱导的启动子会好做得多吧？

总之感觉你们的这个思路很怪异，可能是信息不足，不知道你们的实验目的到底是什么？如果是想研究调控，还可以理解，把UTR加上去，但是如果就是为了降低表达量，则实在没有必要，有的是商业化的载体可供选择的，找个弱启动子的或者可诱导启动子得容易得多吧

信息不足，供参考
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发表于 2013-12-7 16:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
相关疾病：
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你好，再次感谢你的热心回复。我们是研究信号通路的。想用逆转录病毒表达目的基因。前一段时间，我们用另一个载体在293里表达了这个基因，表达量很高，然后我们多表达目的基因和非表达目的基因的293T细胞做了genearray分析，没有发现这个基因过表达后对其他基因有什么调控。所以老板很恼火，说可能表达太高了，所以他又想让构建这个基因的病毒载体，感染MEF细胞，建立稳定表达系，然后再做genearray分析。加UTR的目的就是为了目的基因不要太过高表达，能让western 检测到就行。因为这个基因很奇怪，敲出以后，小鼠表现出生理缺陷，当我们用不同细胞因子处理各种细胞系的时候，这个基因没什么变化。这个基因一般在细胞里的mRNA水平比较高，但蛋白水平非常低，几乎用western检测不到。我这种情况，你能在给点建议吗，谢谢
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发表于 2013-12-7 16:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
感染
首先，根据你的描述，我认为你们最初是打算做该基因的“下游”信号通路。如果这个理解正确，我认为没有必要掺和UTR的问题，甚至目前没有必要考虑表达量的问题，因为“他又想让构建这个基因的病毒载体，感染MEF细胞，建立稳定表达系”，也就是说是放到一个新的表达系统里去了，很可能没有表达量高的问题了。总之，如果只是打算“降低该基因表达量”，我认为没有必要如此折腾。

但是，还是根据你的描述，我认为您可能对您导师的目的理解有偏差，您的老师选择放进UTR的问题进去，可能是别的考虑。原因是“这个基因一般在细胞里的mRNA水平比较高，但蛋白水平非常低，几乎用western检测不到”，这有两个可能，一个是技术问题，WB没做好；另一个就是实际的调控问题，也就是说，是该基因受到转录后调控明显，mRNA很多，但是大多降解了，导致最后蛋白减少，因此你老板想把UTR加进去，目的不是单纯的降低表达量，而是检测转录后调控，也就是检测该基因“上游”调控改基因的因素。

所以最主要的一句话，目的决定方法，先搞清楚实验目的是什么，你们提出的科学问题到底是什么，然后决定如何去设计实验。

另外讨论下“这个基因很奇怪，敲出以后，小鼠表现出生理缺陷，当我们用不同细胞因子处理各种细胞系的时候，这个基因没什么变化。”可能性很多，举几个例子供参考：
1。该基因敲除后表现出的表型，不一定是由于改基因，而是由于该基因的敲除导致了别的基因变化所致，所以一般要确定的话需要做回复或者conditional knockout以便确定；
2。您应该想说的是用不同细胞因子处理，表达无变化吧？那还要看该基因是什么基因，许多转录因子或者调控基因，表达量变化并不大，调控的机制主要是磷酸化等等翻译后修饰的改变，这也可以解释Knockout有表型的问题。

以上供参考，祝好运！
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txwuyan[使用道具]
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发表于 2013-12-7 16:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
最近要构建载体，我是新手，大家帮帮忙啊。
老板让我把5‘非编码区加在目的基因前面，然后在5’UTR和目的基因之间加上flag标签。
我想直接设计一对引物，一次扩出5,UTR和目的基因，然后加在载体上。为了能加上flag，在设计引物的时候，上游引物的5’端加上Flag序列及ATG。这样得到的序列就是：部分5‘UTR+Flag+剩余的5'UTR+目的基因的CDS。各位高手看看，这个思路行吗，如果不行请给个好的建议，谢谢。
还有就是，把CDS里的ATG不删除行吗。

==========================================================================================

序列应该是5‘UTR+ATG+Flag+目的基因的CDS+3’UTE, Flag应该是和目的基因5‘融合表达。CDS里的ATG需删除。
如果嫌载体启动子太强，再构建载体是需将其除去。
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 小中大


QUOTE:
原帖由 txwuyan 于 2013-12-7 16:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
最近要构建载体，我是新手，大家帮帮忙啊。
老板让我把5‘非编码区加在目的基因前面，然后在5’UTR和目的基因之间加上flag标签。
我想直接设计一对引物，一次扩出5,UTR和目的基因，然后加在载体上。为了能加上flag，在设计引物的 ...

Flag为什么必须加在5‘端？我觉得应该是两端都可以吧，我没有做过flag，不过我印象中大部分的tag都是可以两端的，我查了下wiki，
cuturl('http://en.wikipedia.org/wiki/FLAG-tag')

上面说“It can be fused to the C-terminus or the N-terminus of a protein. Some commercially available antibodies (e.g., M1/4E11) recognize the epitope only when it is present at the N-terminal.”
所以是不是因为后一句，有些抗体只能识别N端所以才加在5’端？不过应该也有能识别C端的吧？

而且，楼主应该是换表达系统了，所以载体、宿主等等可能都换了，也许tag也可以换了呢，呵呵，供参考哈
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