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标题:【求助】超声破碎之前是否应加溶菌酶

skytree[使用道具]
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发表于 2013-12-7 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】超声破碎之前是否应加溶菌酶


BL21(DE3）诱导表达后的，超声破碎之后，高速离心分别取上清，以及沉淀重悬液跑SDS-page，结果上清中的蛋白含量很少，但是沉淀中很多。出现这样的情况是不是因为我的菌体很多没有破碎完全，所以沉淀中目的蛋白量比较多，这影响判断包涵体表达吗？是不是在超声之前加点溶菌酶会排除这样的误差干扰？加溶菌酶有没有什么不利的因素？感谢各位指导
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lorri[使用道具]
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发表于 2013-12-7 16:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #1 skytree 的帖子

不需要加溶菌酶，超声完全，以溶液不再象泥沙样浑浊为标准，溶液变澄清，沉淀中较多，说明蛋白以包涵体形势存在。
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skytree[使用道具]
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发表于 2013-12-7 16:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 lorri 于 2013-12-7 16:23 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
不需要加溶菌酶，超声完全，以溶液不再象泥沙样浑浊为标准，溶液变澄清，沉淀中较多，说明蛋白以包涵体形势存在。

首先感谢阁下的关注。您说的标准应该是小样菌体吧，我一般摇1L的菌，大约有6g的湿菌，裂解缓冲液25ml/g重悬沉淀，然后全部拿去超声，从泥沙样浑浊状态到澄清，没实现过，所以也不知道怎么判定是否完全破碎。因为菌体较多，超声时间过长，有些蛋白碳化的现象了，所以一般到“某种”状态，我就不超了。
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taoshengyijiu[使用道具]
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发表于 2013-12-7 16:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议分成多管再进行超声破碎，这样的话比较彻底，6g湿菌一起超声的话，时间长，产生的热量也多，蛋白也容易降解，同时超声不彻底，不好判断。
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yysr238[使用道具]
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发表于 2013-12-7 16:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果蛋白很珍贵，那就是用商业化的裂解液，譬如默克/NOVAGEN的bugbuster，针对GST等大标签的可溶性融合蛋白很适用；如果蛋白表达量很高很容易得到，那就超声吧，个人感觉超声到菌液透明的程度很难把握（尤其是菌液量比较大的情况下），毕竟超声功率和超声时间很难优化。
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skytree[使用道具]
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发表于 2013-12-7 16:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 taoshengyijiu 于 2013-12-7 16:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

建议分成多管再进行超声破碎，这样的话比较彻底，6g湿菌一起超声的话，时间长，产生的热量也多，蛋白也容易降解，同时超声不彻底，不好判断。

谢谢，的确是这样的，分管超可以更容易判断，谢谢
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woshituzhu[使用道具]
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发表于 2013-12-7 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我摇2L的菌液后大概可以收到7g湿菌体，然后不加溶菌酶直接超声15分钟，感觉效果挺好，过程参照分子克隆。如果你的目的蛋白和溶菌酶相差很大，可以加一下比较破碎效果
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发表于 2013-12-7 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 skytree 于 2013-12-7 16:23 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


首先感谢阁下的关注。您说的标准应该是小样菌体吧，我一般摇1L的菌，大约有6g的湿菌，裂解缓冲液25ml/g重悬沉淀，然后全部拿去超声，从泥沙样浑浊状态到澄清，没实现过，所以也不知道怎么判定是否完全破碎。因为菌体较多，超声时间 ...

不要说6g菌，选择好超声探头和超声功率，100g菌体，1000ml破菌缓冲液也可以用超声一次来破菌。

“蛋白炭化”应该是不可能的啦。

超声破菌要注意的是降温。冰水浴不可少，破菌液也可预冷。

一般用工作4秒，间隙4秒，超声200次足够了。总时间大约25min。

对破菌来说，没有必要去判定是否完全破碎。因为你要的是重组蛋白，而不是破菌率。即使有部分菌体没有破碎又有何妨呢。
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发表于 2013-12-7 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可以采用先加溶菌酶破壁，然后放在磁力搅拌器上搅拌，大约30min变成粘稠状即可，然后超生，常规功率，超3s，歇3s，就可以离心了，菌体一般摇个200-300ml。
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skytree[使用道具]
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发表于 2013-12-7 16:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 u234 于 2013-12-7 16:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


不要说6g菌，选择好超声探头和超声功率，100g菌体，1000ml破菌缓冲液也可以用超声一次来破菌。

“蛋白炭化”应该是不可能的啦。

超声破菌要注意的是降温。冰水浴不可少，破菌液也可预冷。

一般用工作4秒，间隙4秒，超声200 ...

非常感谢u234的建议！可否指导下超声探头和功率有什么需要注意到事项吗？谢谢
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