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标题:【求助】急求 2-D遭遇各种问题

寻梅[使用道具]
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发表于 2013-12-7 20:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】急求 2-D遭遇各种问题


裂解液、水化液均购于Bio-Rad，为什么聚焦时电压上不到4000V？
胶条放置聚焦盘中并没有气泡啊，可是跑胶时产生一堆气泡，基本都在碱性段；
第一向等电聚焦过后胶条膨胀是怎么回事的？
急死了，拜求原因及解决方法~~~~
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pengke1983[使用道具]
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发表于 2013-12-7 20:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主，过程详细点，才好分析，特别是蛋白提取及处理！！
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寻梅[使用道具]
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发表于 2013-12-7 20:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

蛋白提取使用的是Bio-Rad的细胞裂解液，PSB powder 和PSB diluent 都是按照伯乐说明书混合，然后分装，使用的时候1ml的裂解lysis+9.8mg DTT+10微升Protease inhibitor+ 10微升Carrier ampholyte配置成裂解液
10的7次方细胞用了1ml裂解液经过振荡离心（10摄氏度下）取出上清液，-75摄氏度保存
第一相等电聚焦蛋白206微克+水化液（Bio-Rad），总上样量是200微升，7cm胶条，pH3-10，设置主动水化（12h,50v,20摄氏度）、除盐（30min,250v,linear） 、除盐（30min,500v,rapid）、升压（3h,4000v,linear）、聚焦（20000v*h,4000v,rapid）最后是500v保持。
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pengke1983[使用道具]
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发表于 2013-12-7 20:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可以试试除盐（2h,250v）、除盐（2h,500v）、升压（30min,1000v）、升压（1h,4000v）、聚焦（30000v*h,4000v,rapid）最后是500v保持。
楼主用的主动水化，有必要延长低压除盐的时间！
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发表于 2013-12-7 20:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你这个问题很简单，仍旧是样品处理问题，盐离子浓度过高。解决办法：收集细胞后用PBS洗两遍。最后一遍加PBS后，离心，弃上清；然后再短暂离心，小心弃上清；用剪得很细的定性滤纸将EP管中残留的液体蘸干。OK，可以加裂解液了。如果你对自己没信心的话，用GE的clean up试剂盒处理一下；如果还对自己没信心的话，呵呵，找我们得了。
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发表于 2013-12-7 20:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 箭头儿 于 2013-12-7 20:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你这个问题很简单，仍旧是样品处理问题，盐离子浓度过高。解决办法：收集细胞后用PBS洗两遍。最后一遍加PBS后，离心，弃上清；然后再短暂离心，小心弃上清；用剪得很细的定性滤纸将EP管中残留的液体蘸干。OK，可以加裂解液了。如果你 ...

已经购买了bio-rad的cleanup,试试看~~~
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发表于 2013-12-7 20:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 箭头儿 于 2013-12-7 20:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你这个问题很简单，仍旧是样品处理问题，盐离子浓度过高。解决办法：收集细胞后用PBS洗两遍。最后一遍加PBS后，离心，弃上清；然后再短暂离心，小心弃上清；用剪得很细的定性滤纸将EP管中残留的液体蘸干。OK，可以加裂解液了。如果你 ...


胶条变胖是怎么一回事？也是和盐浓度有关么 ？
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pengke1983[使用道具]
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发表于 2013-12-7 20:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

7cm胶条，200ul的的水化液有点多，1330-150ul就够了，胶条变胖可能与上样体积有关！！
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feima+[使用道具]
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发表于 2013-12-7 20:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
胶条当然会变胖，因为你买来的胶条是干胶条，吸了液体就膨胀了，所以叫“泡胀”。这就好比方便面，煮了以后就变胖了。
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 小中大


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原帖由 feima+ 于 2013-12-7 20:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
胶条当然会变胖，因为你买来的胶条是干胶条，吸了液体就膨胀了，所以叫“泡胀”。这就好比方便面，煮了以后就变胖了。

泡胀很不均匀，基本都是碱性端胀的厉害的，二向时与凝胶贴合不紧呀~~~~~另一端会翘起一些
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