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标题:【求助】纯化酶切后的膜蛋白做Western blot没条带，why？

misswu61[使用道具]
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发表于 2013-12-7 20:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】纯化酶切后的膜蛋白做Western blot没条带，why？


各位大侠，大家好！
我现在在做膜蛋白，使用麦芽糖蛋白融合膜蛋白在大肠杆菌表达，在纯化后得到麦芽糖蛋白融合的膜蛋白，为了得到目的蛋白，使用内切酶切掉麦芽糖蛋白。
酶切前做麦芽糖蛋白融合的膜蛋白的Western blot有带
很奇怪的是，酶切后，在考马斯亮蓝染后表明麦芽糖蛋白和膜蛋白切开了，但是做Western blot却没有带，why？（使用His-tag，该标签在膜蛋白的C端，酶切后在膜蛋白上）
难道因为膜蛋白的疏水性没有转到硝酸纤维素膜上？
各位大侠，帮我分析一下啊,谢谢！
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daod[使用道具]
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发表于 2013-12-7 20:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
膜上有没有你要的蛋白染下色看看呗
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utt0989[使用道具]
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发表于 2013-12-7 20:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

用的是什么一抗？

实验的详细步骤是什么？
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misswu61[使用道具]
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发表于 2013-12-7 20:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 utt0989 于 2013-12-7 20:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

用的是什么一抗？

实验的详细步骤是什么？

膜蛋白上的C端有his-tag，一抗是针对his-tag的抗体，二抗是“辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG”
按照wb操作进行
在WB时，有阳性对照，阳性出来了，酶切前的膜蛋白在WB中有带，但是酶切后膜蛋白没有条带
难道我的目的膜蛋白降解了？
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qiangren789[使用道具]
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发表于 2013-12-7 20:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 misswu61 于 2013-12-7 20:19 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


膜蛋白上的C端有his-tag，一抗是针对his-tag的抗体，二抗是“辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG”
按照wb操作进行
在WB时，有阳性对照，阳性出来了，酶切前的膜蛋白在WB中有带，但是酶切后膜蛋白没有条带
难道我的目的膜蛋白降解 ...

酶切后是不是分子量变小很多，在转膜过程中没有转到膜上，你转膜时的分子量MARKER转的效果怎么样？
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misswu61[使用道具]
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发表于 2013-12-7 20:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #5 qiangren789 的帖子

MARKER转的效果不错，酶切后分子量是变小了，但是也有个40KDa啊，怎么就没有呢？请您指教！
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hot_hot_hot[使用道具]
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发表于 2013-12-7 20:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
建议你把切了的和没切的都跑胶转移做WB看看两者是否有区别吧
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misswu61[使用道具]
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发表于 2013-12-7 20:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #7 hot_hot_hot 的帖子

做了，在同一块胶上做的，酶切前的跑出来了，酶切后的没跑出来
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