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标题:【求助】pET32a+在BL21DE3中的表达(更新)

bgf5[使用道具]
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发表于 2013-12-7 20:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】pET32a+在BL21DE3中的表达(更新)


最近翻看pET载体的手册，发现上面要求用不超过烧瓶总体积的20%来摇菌。但是我平时都是用50%的体积来摇菌的呀，也就是2L的瓶子摇1L的菌液。难道说这是实验不成功的原因？

请高人指点.

后来发现,摇菌的体积也不是大问题,开始试条件,现已经试完37度的条件.

最后我发现是那个R 250的染料有问题. 多谢这里战友为我分忧....也希望大家吸取我的教训..


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2013-12-7 20:30
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发表于 2013-12-7 20:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #1 bgf5 的帖子

溶氧也是必须的~~
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发表于 2013-12-7 20:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
给氧量是否充足会影响蛋白的产量及蛋白的可溶性。
如果目的蛋白主要分布于包涵体，而需要目的蛋白以可溶形式表达的时候，可以考虑适当减少每个摇瓶内培养基的量以改善供氧情况。
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发表于 2013-12-7 20:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

o 茅塞顿开......正如楼上所说,我收集的是可溶的目的蛋白,同时有相当的目的蛋白是包涵体
我今天在比较不同培养基百分比对可溶性目的蛋白表达量的影响.
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发表于 2013-12-7 20:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
别具了。。。。还是不行。。试过用少一点medium但是表达量还是很低。。。
之前师姐做的时候表达量很高，但是不知道为什么我用相同的条件就表达不出来。。。。
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发表于 2013-12-7 20:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

大家用LB medium的时候都调不调pH呀？pH调到7.5？
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发表于 2013-12-7 20:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我一直都是用2L瓶子要1L这个氧气没问题，你要优化的是诱导的温度，和诱导时间啥的
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发表于 2013-12-7 20:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

多谢楼上, 我正在优化时间和IPTG, 温度还没有优化.
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发表于 2013-12-7 20:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

昨天问了过去提这个蛋白的师姐,她指出了一个过去我没有想过的问题.

我一直都是用BL21来扩增质粒,而当时师姐用的DH5a.可能是质粒的质量不高?

我后来测了我提的质粒的浓度, 50ng/ul 是不是有些低呀.
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发表于 2013-12-7 20:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

自己顶一下, 大家transform competent cell用的质粒是从DH5a 还是BL21上提的.
有没有可能, BL21提出来质粒质量比较差, 所以当我再次transform BL21来提蛋白的时候产量降低???
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