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标题:【求助】WB总不出结果啊，真愁死了

JK.jon[使用道具]
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发表于 2013-12-7 21:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】WB总不出结果啊，真愁死了


WB 一直出不来条带，帮我支支招吧。
我得实验条件是：
转22kd的蛋白.
12%的分离胶，85V过浓缩胶，135V过分离胶.
0.2 NC膜，300mA转1h。

用两只不同的相同分子量的抗体都不出条带，怀疑是没有转到膜上，那我转膜条件怎么改变一下比较好呢？
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glass[使用道具]
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发表于 2013-12-7 21:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

要怀疑没转上的话，最好电泳时点个预染的Marker，如果转完没有Marker条带就要改变转膜条件了
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bananapeople[使用道具]
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发表于 2013-12-7 21:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

内参能杂出来吗？如果内参杂出来没有问题，那就说明转膜至少部分成功。
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小荷尖尖[使用道具]
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发表于 2013-12-7 21:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1、转膜时间过长，22kd不需要1个小时就能转上。
2、缓冲液粒sds过多。
3、缓冲液甲醇过少
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tieshazhang[使用道具]
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发表于 2013-12-7 21:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做过21kd的 做出过 ，刚开始也是做不出，后来就做出来了。我觉得可能你本身蛋白表达丰度低，分离胶用15%，转膜1个小时没问题的，100v，当然也与你用的抗体品牌有关，有的要求上样量高低有关。
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JK.jon[使用道具]
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发表于 2013-12-7 21:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 glass 于 2013-12-7 21:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

要怀疑没转上的话，最好电泳时点个预染的Marker，如果转完没有Marker条带就要改变转膜条件了

每次marker都转的很清楚
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JK.jon[使用道具]
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发表于 2013-12-7 21:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 bananapeople 于 2013-12-7 21:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

内参能杂出来吗？如果内参杂出来没有问题，那就说明转膜至少部分成功。

内参没有到货呢
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JK.jon[使用道具]
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发表于 2013-12-7 21:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 小荷尖尖 于 2013-12-7 21:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

1、转膜时间过长，22kd不需要1个小时就能转上。
2、缓冲液粒sds过多。
3、缓冲液甲醇过少

那我重新配一批buffer吧，不过用这批buffer跑别的kd的条带出来了，就是这个小分子量的不出来，我们实验室公用电泳试剂。
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windboy[使用道具]
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发表于 2013-12-7 21:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我经常转22kd的蛋白，我觉得你的问题是转膜时间过长，我分离胶10%，转膜35min。
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JK.jon[使用道具]
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发表于 2013-12-7 21:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 windboy 于 2013-12-7 21:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我经常转22kd的蛋白，我觉得你的问题是转膜时间过长，我分离胶10%，转膜35min。


我试试。
我转过1h，2h，3h。发现1h的时候考马斯亮蓝染色胶发现很多蛋白，觉得蛋白没有转膜过去，2h就转的很干净了，但是可能也转过去了。我试试35min，再试试吧。
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