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标题:【讨论帖】有关异源表达的讨论

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发表于 2013-12-7 22:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【讨论帖】有关异源表达的讨论


异源蛋白的表达是个很复杂的问题，有许许多多的影响因素，而且由于蛋白本身千差万别，很难有一个很完善或很标准的流程方法。

另外，表达的宿主也是多种多样，目前比较常用的包括E.coli，酵母（以甲醇酵母居多），昆虫细胞，哺乳动物细胞等，各自有着其本身的特点，优缺点各异。

但是，异源表达又是分子生物学中很重要的一个工具，论坛里不少战友都在做这方面的工作，许多帖子在讨论这方面的问题。因此想发起一个针对这方面的专题讨论，希望有助于大家的工作，当然也希望能对自己的工作有所帮助，欢迎大家讨论。

还有，由于本人只做了有关E.coli和甲醇酵母的工作，其他虽然我们研究所也有人做，但毕竟本身没做过，若有错误或不严谨的地方欢迎战友们指正。
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发表于 2013-12-7 22:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

首先在这里提出几方面问题，希望大家讨论：

1. 宿主的选择。

表达宿主虽众多，但比较常用的也就E.coli，酵母（以甲醇酵母居多），昆虫细胞，哺乳动物细胞等，各自代表了一种体系。

E.coli 原核宿主，无翻译后修饰。但周期短、费用低、表达量大，一直是最常用的宿主之一。蛋白一般很好表达，量很大，但很可能由于蛋白的翻译后修饰不完善而没有活性(或形成包涵体)，尤其是表达真核蛋白时最应注意。

酵母，有了比较完备的翻译后修饰系统，尤其是糖基化。但是个人感觉酵母表达异源蛋白时对蛋白本身的特点要求很大，有的蛋白表达量非常大，有的却几乎一点也没有，很折磨人。

昆虫细胞和动物细胞本人没有做过，但园子里也有很详细的介绍，搜一下google也有不少，其中还有许多是画成了表格，对比各自的优缺点，网络不好，没找链接，希望有人可以不全，多谢多谢！

另外，也有很多用链霉菌表达的成功实例，不过个人感觉链霉做起来相当麻烦，周期长，转化困难，表达量也没什么优势，而且翻译后修饰虽然也有，但仍与真核差别较大。不过链霉菌有许多次级代谢产物（一些小分子物质）可能比蛋白表达本身更有意义，我们实验室就有很多人在做这方面研究。
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发表于 2013-12-7 22:21 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
2. 转化子、表达子的筛选

转化子的筛选，由于许多质粒是穿梭质粒，因此大多具有E.coli中的抗性筛选标记，筛选起来是很方便的（当然，我不清楚细胞方面的筛选，一般使用病毒载体吧，希望高手们介绍一下）。

但是转化成功的并不意味着能够成功表达目的蛋白了，因此还需要“表达子”的筛选，尤其是整合入基因组的片断（E.coli一般是游离质粒表达，好像不用再筛选了，有就有，没有就没有了）。我做的是毕赤酵母(GS115,pPIC9k)，在筛选过程中遇到了不小的问题，一般如果目的蛋白有些容易检测的特殊活性（比如抑菌活性），则筛选起来是比较容易的。但是如果没有，由于酵母是整合入基因组表达的，就不太好说了，我用原位点杂交的方法筛选过，效果不好，但筛选量倒挺大；还有就是5ml小量发酵筛选，工作量就比较大了，而且筛了400-500个也没有。

还有就是发现不同的筛选方法获得的阳性菌株好像不是很平行，将上述筛到的菌株放大到100ml时就没有了。请教师兄，他说有可能是不同水平发酵溶氧量差别很大，导致酵母生长状态差异，酵母又挺娇气的，差一点也不干活，比较郁闷。不知有没有解决的方法。

不知大家有什么好的筛选方法介绍一下吧。
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发表于 2013-12-7 22:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

3. 稀有密码子

由于是异源表达，不同宿主之间其密码子的偏好性就有不少的差异，这种差异经常直接导致了异源表达的失败。下面有几个问题，我有一些看法，希望大家能给与指导和帮助。

首先，如何确定是否是该问题导致的表达失败。我的一位同学给了我个判断方法的建议，觉得很有道理，和大家分享讨论。他建议我在不同水平简单检测一下表达的情况：基因水平，做个PCR之类的看看是否已成功转入（质粒或整合入宿主）；做个半定量RT-PCR看看mRNA是否转录了；

再看看SDS-PAGE是否有蛋白表达。如果根本转化就失败了，没有什么好说的；如果基因进去了但mRNA没有表达，可能需要考虑启动子的问题，换个强启动子或干脆换个质粒；如果mRNA转录了可没有蛋白翻译，那就需要考虑是否是密码子偏好性或mRNA二级结构的问题了。

然后进一步查证，需要利用软件或上网查找是否存在这样的二级结构，以及是否含有稀有密码子影响了翻译。在这个问题上我试着查了一些网站，如cuturl('http://www.kazusa.or.jp/codon/') ；cuturl('http://gcua.schoedl.de/') ；cuturl('http://www.genebee.msu.su/cgi-bin/nph-rna2.pl')。等等。但是许多东西看不太懂，理解起来有困难。希望能有软件高手详细介绍一下用法，尤其是能分析自己片断是否含有很多稀有密码子或二级结构等。在此感谢了！

接下来就是如果确定有可能是稀有密码子问题如何解决？目前我见到的有两种方法，一是有些宿主比如大肠杆菌的Rosetta，是由BL21改造，整合了含稀有密码子tRNA的片断，使其能顺利表达的新型宿主菌，不知其他种类的宿主是否也有这种商业化的修饰菌；另外就是利用PCR等方法将片断上的稀有密码子改造（突变），换成其他编码同样氨基酸的密码子。当然，还可能干脆就换表达体系了，这一般是大家最不希望的了。
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 小中大

4. 菌种的保存、退化

一般来说是加甘油20%左右，-70保存；或制成干粉保存。但是在做甲醇酵母时发现了个问题，就是重组工程菌的退化现象比较严重，一般都是学生做得好好的，但是毕业以后下面的师弟一接手，蛋白就不表达了，或表达量非常的低。连续好几个师兄的结果都是如此，很是奇怪。我猜测可能是由于整合入基因组，毕竟是个外源的基因，不知整合到了染色体的什么部分，会不会过段时间就给“踢”下来，或就沉寂了？E.coli在复苏时都有抗性压着，酵母好像没有太合适的（不知pPICZ系列的那个抗生素好用不好用，但毕竟好贵
）。

我有个想法，是否也应像公司在做工程细胞时那样，挑个几十上百个，一起传代，10几代后仍然稳定表达的才说明基因整合到了合适的部位，不会再下来了？但是毕竟做研究生没那么多时间来干这个，否则万一不行毕业就困难了。有没有其他解决方法呢？盼高手。
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发表于 2013-12-7 22:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

另外，再次说一下，由于本人只做过E.coli和酵母，而且都不是太成功，仍然努力中，其他更是只看过没上手，如有不正确之处希望各位战友指正。而且我的题目是异源表达，不仅只针对我做的这两种体系，但是由于个人水平有限，只能大多局限于此，希望大家讨论补充！
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 小中大
5. 拷贝数对表达量的影响

对于“游离”的质粒，比如E.coli的BL21表达时，质粒的拷贝数是否对表达量有所影响？当然，由于大肠表达最主要的问题经常是表达太高了形成了包涵体，所以说白了应该希望表达量更低点的可能比较多，经常尝试各种方法（低温、低浓度IPTG等等）来降低表达量。那么BL21中的质粒是否是单拷贝的呢（没查过，不太清楚）？如果不是，能否通过降低拷贝数来降低表达量防止包涵体的形成呢？

至于酵母那种整合到基因组中的质粒，那么拷贝数是否对表达量有影响呢？通过我自己的经历，个人猜测还是有的。在上面讨论了菌种的退化问题，1年左右，重组的酵母表达蛋白就消失了。但是我曾经将这些蛋白表达消失的重组菌作了PCR鉴定，发现外源的片断仍然是存在的，就是不表达了，那么是什么原因呢？我有几种猜测：一是可能整合的位置恰好是染色体的沉寂区了，过段时间以后就沉默了，不表达了；还有一种就是会不会是原来是高拷贝的重组菌在冻存以后退化了，变成低拷贝的了（也就是可能有蛋白表达但量很低了）。当然，我后来没有作进一步的验证，比如做个杂交确证以下拷贝数到底多少，只是一种猜测。

那么，如何提高重组酵母菌的拷贝数呢？对于较早的PAO815质粒，采用的多是体外重组的方法达到高拷贝后再转化；对于pPICZ系列和pPIC9k等等则分别采用Zeocin和G418抗生素筛选的方法筛选高拷贝的质粒；园子里还讨论过一种多重转化获得高拷贝重组菌的方法也值得一试（如下）：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/870484_0.html')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=870387&sty=1&tpg=1&age=0')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/871140_0.html')

欢迎大家讨论！
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发表于 2013-12-7 22:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主，真好心！
我现在在做一个来源于鸡的目的基因的原核表达，用的是pQE30载体，M15表达菌株，SDS-PAGE检测未见表达，我的目的基因是人工合成的，我对它进行了稀有密码子改造，请帮我分析不表达的原因可否？
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 小中大

相关疾病：
乙型肝炎
我也发表几句。
我是做酵母表达的，算是比较成功的，已载SCI上发表了文章。
毕赤酵母表达系统是应用最为广泛的酵母表达系统，近年来发展非常迅速，目前已利用此系统表达了一系列有重要生物学活性的蛋自质，如破伤风毒素片段C、肠激酶、乙肝表面抗原、肿瘤坏死因子、表皮生长因子等。其主要的优点有：1. 具有醇氧化酶AOX1基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一；2.外源基因整合在酵母基因组上，可以稳定存在；3.高效分泌表达质粒能将外源蛋白表达后，进行翻译后加工处理，将外源蛋白分泌到细胞外，不但提高表达蛋白的活性，而且有利于产物的纯化；4. 菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高，适于大规模工业生产。
我的感觉是，如果想表达高度活性、高产量的真核来源的蛋白时，首选酵母，尤其你想工业化生产的时候，酵母更是第一选择。
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发表于 2013-12-7 22:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

感谢有人来讨论了，欢迎欢迎！

你说的载体和宿主我都没有用过，只能大致分析，异源表达本身影响因素太多了，但是个人认为最根本的还是要表达的目的片断本身的特点，你既然已作了密码子改造，仍然没有表达，不知是否分析过mRNA结构的问题。

我不太清楚这种体系的特点，有没有可能也是找找看在那个水平开始表达中断了？或者就干脆换体系，一般原核的体系周期应该还是比较短的（当然也有长的，不知你这怎样，也介绍一下吧），换一个还来得及吧。
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