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标题:【求助】等电聚焦结束后酸性端有白色物质析出

lagua123[使用道具]
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发表于 2013-12-7 23:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】等电聚焦结束后酸性端有白色物质析出

各位大侠，我跑的是微生物胞外酶的双向电泳实验，这两次换了一个新的蛋白样品来做，发现每次等电聚焦结束后，胶条从中间位置到酸性端有白色的物质析出，半个胶条都呈白色的。但是等电聚焦能按照设定的程序进行，能达到最高电压。电泳图谱酸性端几乎都看不见蛋白点，而且还有一个很大的纵条纹，请各位帮帮忙，该如何解决？万分感激
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lagua123[使用道具]
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发表于 2013-12-7 23:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我从两方面考虑这个问题：
1 由于等电聚焦仪不平或者矿物油不够导致酸性端胶条暴露没有矿物油覆盖，使尿素结晶析出
但是我个人觉得我等电聚焦仪已调整水平，矿物油也加了四五毫升，应该不是这种原因吧
2 样品自身的问题，我之前的一种样品没有出现过这种情况，但是换了这种样品后就一直这样
请各位帮帮忙啊
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发表于 2013-12-7 23:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
服了，我做24厘米的胶条也没有加过矿物油4-5毫升啊，一般也就是1毫升左右，有时候会稍微多一点
第一，你的胶槽有没有用纯水冲洗，如果没有洗干净的话，样品也会分布不均
第二，你的上样量如何，上样的时候桌面是否水平，否则样品会跑到一边
第三，矿物油不能加太多，会溢出电泳槽来，会短路吧

看了你的图之后，觉得你的一项的IEF貌似就没有分开嘛，一项水平等电聚焦，二项垂直电泳，从你的图片上看，觉得样品没有聚焦成功呢

还有你的样品是怎么处理的呢，觉得问题还是挺多的，你的裂解液重涨液那些有没有问题呢，自己多看下文献，好好分析下哦
我也是去年这个时候开始做2DE的，大冷天的非常痛苦，要好好坚持啊，呵呵
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lagua123[使用道具]
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发表于 2013-12-7 23:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 喵咪 于 2013-12-7 23:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
服了，我做24厘米的胶条也没有加过矿物油4-5毫升啊，一般也就是1毫升左右，有时候会稍微多一点
第一，你的胶槽有没有用纯水冲洗，如果没有洗干净的话，样品也会分布不均
第二，你的上样量如何，上样的时候桌面是否水平，否则样品会跑到 ...


我做的是微生物胞外酶，用缓冲液浸提后，再用TCA-丙酮沉淀去除杂质，但是TCA-丙酮处理后蛋白比较难溶，18cm pH3-10NL的胶条上样量才达到180微克左右，我的聚焦槽都是用双蒸水冲洗过，泡胀盘也调成水平了
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喵咪[使用道具]
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发表于 2013-12-7 23:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

回复 #4 lagua123 的帖子

sorry，我不是很了解这个，我是做组织的
看看有没有其他高手帮你解决一下
我觉得你的蛋白难容是一个问题诶，在看看文献了
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大海啊故乡[使用道具]
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发表于 2013-12-7 23:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的样品难溶，可以考虑在上样buffer里加30mM-40mM左右的Tris，可以帮助溶解
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rxcc33[使用道具]
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发表于 2013-12-7 23:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 大海啊故乡 于 2013-12-7 23:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你的样品难溶，可以考虑在上样buffer里加30mM-40mM左右的Tris，可以帮助溶解

赞同这个观点。
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lagua123[使用道具]
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发表于 2013-12-7 23:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 大海啊故乡 于 2013-12-7 23:32 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你的样品难溶，可以考虑在上样buffer里加30mM-40mM左右的Tris，可以帮助溶解


在水化液中加入Tris会不会造成离子浓度过高，导致电压升不上去啊？
我的水化液配方是：尿素 8M， CHAPS 4%，IPG buffer 0.5%
，溴酚蓝 0.002%，DTT 20mM,这个配方是否需要改进？
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