【讨论帖】关于如何提蛋白质纯化问题

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标题:【讨论帖】关于如何提蛋白质纯化问题

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发表于 2013-12-9 17:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

在得不到足够信息的情况下，往往比较难以分析，大家多是在假定一些信息来回答问题，这样有时候碰巧符合了，但也有推断错误的时候。这样对解决问题是不利的。
如果不涉及到技术保密问题，关于蛋白质纯化问题都建议按下列信息来提问。

1、建议贴张SDS-PAGE图来分析一下，最好包括：
Marker，胶浓度，变性还是非变性
诱导前
诱导后
破菌上清
破菌沉淀
沉淀洗涤上清
变性溶解上清
变性溶解沉淀
柱纯化前
柱纯化穿透
柱洗脱
等各个样品。
标上marker大小，电泳条带说明，从左到右，或1234567.....

2、建议把流程中的各个部分所用缓冲液说明一下，例如：
破菌缓冲液:如pH8.0，20mMTris，0.5N NaCl
破菌方法：如超声，4s工作，4s间隙，冰水浴，共200次
包涵体洗涤液：如PBS（pH7.4，20mM PB，0.15N NaCl）
包涵体溶解液：如pH8.0，20mMTris，0.5N NaCl，8M尿素
柱平衡液：如pH8.0，20mMTris，0.5N NaCl，8M尿素，20mM 咪唑
柱淋洗液：如pH8.0，20mMTris，0.5N NaCl，8M尿素，40mM 咪唑
柱洗脱液：如pH8.0，20mMTris，0.5N NaCl，8M尿素，200mM 咪唑
柱洗脱方法：如分段洗脱，线性梯度洗脱等

3、建议说明纯化规模和纯化设备，例如：
一次纯化所用的菌体量：如10g湿菌体或500ml摇瓶发酵菌等
破菌缓冲液体积：如150ml
包涵体洗涤，溶解液体积：包涵体洗涤液每次150ml，共洗涤3次；包涵体用50ml包涵体溶解液溶解，搅拌过夜
纯化用柱类型：如XK26/20、或自制、或国产16/20、或预装柱等
纯化用柱大小：如40ml
柱淋洗液用量：如200ml
柱洗脱液用量：如150ml
纯化仪器：如国产、AKTA Explorer 100、Duoflow

4、建议适当说明目标蛋白的性质，例如：
载体类型：PET32a
Tag类型：融合硫氧还蛋白，histag6
理论分子量：如融合蛋白共35kd，目标蛋白17kd（不含硫氧还蛋白）
理论等电点：如融合蛋白pI7.0，目标蛋白pI8.5等

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发表于 2013-12-9 17:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

（第三孔开始）1Marker，2未32a ，3诱32a，4未诱32aA3，5诱32aA3（全菌），6诱32aA3（沉淀），7诱32aA3（上清），8诱过柱32aA3（上清），9诱过柱32aA3（上清），10M
图：6.7可能样品有问题

上清洗脱，上清穿透，M，包洗脱，包洗杂，包穿透，全菌，未诱菌，包过柱前，纯化的上清蛋白（最终），PBS洗超滤管，纯化的上清蛋白（中间）
另一张图见下楼！！！~

一次纯化所用的菌体量：100ml
包涵体洗涤：每次我就吸1ml洗，洗3次
菌洗液：0.9% NaCl
破菌缓冲液：20mM 磷酸钠 500mM 氯化钠 pH 7.4 （2ml）+ Tris-Hcl pH8.0 （3ml）
破菌方法：超声 3s （工作），2s（休息），400W，30min
包涵体洗涤液：20mM 磷酸钠 500mM 氯化钠 2M 尿素 0.1%Tritonx-100 pH 7.4
包涵体溶解液：20mM 磷酸钠 500mM 氯化钠 8M 尿素 pH 7.4
柱平衡液：50mM PBS缓冲液（磷酸钠，氯化钠）含8M尿素
柱淋洗液：淋洗液是否是洗杂的？我用含50mM的柱平衡液成分
柱洗脱液：含400mM柱平衡液成分
柱洗脱方法：镍NTA琼脂糖凝胶FF（不知道有没NTA）
柱图和超滤管：
目标蛋白的性质
载体类型：pet-32a Tag类型：
理论分子量：17.多kd（可能是蛋白的，融合后有40多吧）
理论等电点：4.多

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2013-12-9 17:35

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发表于 2013-12-9 17:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1上清洗脱，2上清穿透，3M，4包洗脱（包涵体的都没蛋白），5包洗杂，6包穿透，7全菌，8未诱菌，9包过柱前，10纯化的上清蛋白（最终），11PBS洗超滤管（没用），12纯化的上清蛋白（中间）

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2013-12-9 17:36

17461277.jpg (8.93 KB)

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发表于 2013-12-9 17:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

柱图和超滤管：

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2013-12-9 17:36

47484866.jpg (10.3 KB)

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发表于 2013-12-9 17:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我研究的可溶表达有所进展，上面图有上清表达的蛋白，量还行吧？
加咪唑，调节pH，上Ni柱。为什么上住前要加咪唑，我没加，对了我过完镍柱杂带很多，
需要如何快速的处理？我的时间不多了

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发表于 2013-12-9 17:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

现在先做可溶表达，试剂就是没尿素的上述试剂，我需要改进什么呢？大家探讨下

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发表于 2013-12-9 17:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你的纯化程序没有多大问题，电泳纯度看着也还可以（分辨率低，上样量小，看不到杂带）。

上柱前加咪唑的目的是为了减少杂蛋白对Ni柱的吸附。

过完镍柱杂带很多，或许要优化一下洗脱条件，做个分段洗脱。

你的程序是50mM咪唑洗杂蛋白，然后400mM洗脱目标蛋白。你可以在中间增加几步不同咪唑浓度的洗脱，如80、100、150mM咪唑等等。

你的纯化设备太简陋了，不容易，不容易，辛苦。

注意分段洗脱的样品最好全部收集，全部做电泳检定，看目标蛋白在哪一个浓度的咪唑洗脱纯度最好。各阶段的洗脱溶液用多点，因为你的设备关系，柱的性能较差，只能用多点体积的溶液来弥补。

另外，也可以考虑尝试离子交换的方法，推荐先试一试pH7.0-8.0，20mM Tris的Q或DEAE柱，你的融合蛋白应该是吸附的，然后采用分段洗脱方式，如100、150、200、300、500mM NaCl洗脱。同上，要充分，且收样电泳。

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发表于 2013-12-9 17:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

第一张图的89是过柱后的，扎带很多啊，
对了，就我这设备，能怎么搞啊？？我要是弄个1L的菌液，柱子罩的住么？
这样的上清表达是否足够？？
如果我用上清过柱，需要注意些什么问题？

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发表于 2013-12-9 17:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

第二张图的10和12不是纯度还好吗？

1L菌液用20ml左右的柱子完全没有问题。

表达量也还不错啊，第一张图的5，第二张图的7都不错。

结合我的例子和刚才的回答，把尿素去掉就可以了。

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发表于 2013-12-9 17:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

很奇怪的是，第二张的10和12 跟第一张的89是一样的样品啊啊

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