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标题:【讨论帖】蛋白新纯化思路探讨

glass[使用道具]
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发表于 2013-12-9 21:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【讨论帖】蛋白新纯化思路探讨


蛋白新纯化思路探讨

思路：得到需要纯化的样品中所有杂蛋白的抗体，将这些抗体结合到NHS-活化的Sepharose Fast Flow上，然后再将需要纯化的样品过这个柱子，所有杂蛋白都结合在柱子上，目的蛋白穿透出来。

具体例子：原核表达蛋白纯化
1.  无目的基因的PET28a-BL21，菌体超声破碎后离心分上清和沉淀，将上清拿去免疫兔子，得到针对杂蛋白的抗体，将抗体结合到NHS-活化的Sepharose Fast Flow上，命名这根柱子为X。PET28a-目的蛋白1-BL21诱导表达后，菌体超声破碎后离心分上清和沉淀，将上清过X柱，所有杂蛋白跟相应抗体结合，目的蛋白1穿透出来，实现纯化。
2.  无目的基因的PET28a-BL21，菌体超声破碎后离心分上清和沉淀，将沉淀拿去免疫兔子，得到针对杂蛋白的抗体，将抗体结合到NHS-活化的Sepharose Fast Flow上，命名这根柱子为Y。PET28a-目的蛋白2-BL21诱导表达后，菌体超声破碎后离心分上清和沉淀，沉淀用尿素溶解，复性后过Y柱，所有杂蛋白跟相应抗体结合，目的蛋白2穿透出来，实现纯化。
问题肯定会有很多，我们课题组想尝试这样做一些，请大家给点建议，有哪些需要注意的地方，谢谢。
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nn255[使用道具]
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发表于 2013-12-9 21:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你这样的方法可以倒是可以，但是，这样的纯化方法一是周期太长，二是成本太高。我觉得没有办法普及。但是，你的想法确实很有创意。
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glass[使用道具]
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发表于 2013-12-9 21:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 nn255 于 2013-12-9 21:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
你这样的方法可以倒是可以，但是，这样的纯化方法一是周期太长，二是成本太高。我觉得没有办法普及。但是，你的想法确实很有创意。

哦 周期和成本 我现在暂时不会考虑 谢谢
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发表于 2013-12-9 21:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

个人觉得不是很实际，
1. 抗体的制备，以一个非常杂的蛋白混合物进行免疫，然后得到针对每一种抗原的抗体混合物？这个基本无法实现的，且后期的纯化、螯合也不是能理想化的达到预定目标；
2. 活化后各个基团的相互影响以及其结合能力的强弱，稳定性如何，这个恐怕很难保证。
3.退一步讲就算以上所说的都顺利，该柱子的层析效果也值得商榷，是否真的能如预设的一定把所有杂质都结合了？希望很小吧。基本无法实现使目标蛋白流穿的目的；
4.表达的结果不同批次间会有差别，成分也会有所不同，总不至于每一次要制备一个柱子吧。
5.使用不同系统，不同环境与条件的表达产物差别很大，使得这种方法无法像特异性吸附目的蛋白的方法有较广泛的应用（假设其可以用）。
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发表于 2013-12-9 21:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

个人觉得不是很实际，
1. 抗体的制备，以一个非常杂的蛋白混合物进行免疫，然后得到针对每一种抗原的抗体混合物？这个基本无法实现的，且后期的纯化、螯合也不是能理想化的达到预定目标；
2. 活化后各个基团的相互影响以及其结合能力的强弱，稳定性如何，这个恐怕很难保证。
3.退一步讲就算以上所说的都顺利，该柱子的层析效果也值得商榷，是否真的能如预设的一定把所有杂质都结合了？希望很小吧。基本无法实现使目标蛋白流穿的目的；
4.表达的结果不同批次间会有差别，成分也会有所不同，总不至于每一次要制备一个柱子吧。
5.使用不同系统，不同环境与条件的表达产物差别很大，使得这种方法无法像特异性吸附目的蛋白的方法有较广泛的应用（假设其可以用）。
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发表于 2013-12-9 21:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

个人觉得你的想法有些不切实际，举例如下
1、你既然能够制备抗体，为什么不制备目标蛋白的单抗，然后偶联到介质上，用来纯化目标蛋白。
2、能否得到抗所有杂质的抗体还需考证，且一些物质是不会产生抗体的，况且你连杂质都不知道有多少种，是什么成分。
3、自己偶联的亲和层析介质载量很低的，如果杂质量较大，即使产生抗体也会流穿，且杂质的含量各不相同，决定你必须先分析杂质都有什么，比例是多少。
4、本来很简单的试验为什么要设计的很复杂啊，两米的距离你非要向反方向走从地球的另一端到达目标。
但是楼主也有逆向思维的能力，学习了。并祝福楼主能够考虑大家的意见。
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发表于 2013-12-9 21:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 birdfish 于 2013-12-9 21:34 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

个人觉得你的想法有些不切实际，举例如下
1、你既然能够制备抗体，为什么不制备目标蛋白的单抗，然后偶联到介质上，用来纯化目标蛋白。
2、能否得到抗所有杂质的抗体还需考证，且一些物质是不会产生抗体的，况且你连杂质都不知 ...

我导师的目的就是要让目的蛋白穿透 里面有特殊的目的
亲和介质我们倒是自己买的 谢谢你的宝贵意见
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dodoit[使用道具]
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发表于 2013-12-9 21:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

对于一些同源性比较高的蛋白，比如我在大肠杆菌里面表达一个酵母的DNase，或者直接就是大肠杆菌的DNase，很可能就会挂到你的抗体柱上。这种方法个人认为特异性不高，而且单一的抗体—抗原结合只是最理想的情况，柱子上这么多种抗体，说不定有那个就和你的目的蛋白有其他的相互作用（比如疏水、离子键等）。
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glass[使用道具]
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发表于 2013-12-9 21:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 dodoit 于 2013-12-9 21:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

对于一些同源性比较高的蛋白，比如我在大肠杆菌里面表达一个酵母的DNase，或者直接就是大肠杆菌的DNase，很可能就会挂到你的抗体柱上。这种方法个人认为特异性不高，而且单一的抗体—抗原结合只是最理想的情况，柱子上这么多 ...

单一的抗体—抗原结合只是最理想的情况，这个我倒是没有想到 谢谢
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koook5695[使用道具]
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发表于 2013-12-9 21:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

觉得这个想法非常好，但是目前很难实施
一个是比较复杂，成本高，需要寻找更简便的方法
一个是纯化的纯度，只有理论上是成立的
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