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一说起支原体，估计细胞培养的人员就开始手心冒汗了。细胞培养中的急性污染往往容易察觉，而支原体则像慢性毒药一般，杀细胞于无形中。除了非常有经验的老手，很多实验人员都察觉不到支原体的污染。据统计，超过25%的细胞系中感染了支原体，而研究者大多并不知晓。早期，血清可能是主要的污染源；之后，通过实验室的仪器、培养基或其他试剂渐渐蔓延开来，细胞无不中招。怎样才能根除讨厌的支原体污染呢？让我们先来认识这个小东西。生物通 cuturl('www.ebiotrade.com')
狡猾的支原体
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支原体是唯一一种没有细胞壁的原核生物，大多呈不规则球状或丝状。由于它的直径小（约为0.15-2 µm），而且形状灵活，所以能逃过实验室常用的滤膜。支原体的种类非常多，超过了100种。当然，大部分支原体检测都不可能检测到所有的种类。不过，在实验室中捣乱的支原体也通常就是那一小撮。
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支原体生长缓慢，通常不破坏宿主细胞。然而，它们能以许多不同方式改变细胞的新陈代谢。细胞除了长得不好之外，几乎所有的实验表现如蛋白表达也都会受到影响。传统的抗生素对支原体并不奏效，因为它们大多破坏细胞壁的完整性，而支原体恰恰没有细胞壁。这也就是支原体感染率高企的主要原因。曾有一位细胞培养专家戏称：“我可是支原体方面的专家，并不是因为我喜欢他们，而是25-30%的细胞系都感染了支原体。”支原体总在偷偷地改变细胞，篡改我们的实验数据。怎么办？
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检测、检测、再检测
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对培养物进行常规的支原体检测非常重要。尽管各个实验室的检测频率不同，从几个星期到几个月不等，不过这主要取决于你们实验室有多少人接触细胞，以及你们引进新细胞的频率。比如美国国立细胞培养中心（NCCC），它经常从其他实验室获得细胞培养物，就会对每个样品进行检测，并将它们隔离，直至最后证明无支原体污染。一般来说，每两三个月进行一次定期检测是必要的。如果有新细胞进入实验室，或准备将细胞进行液氮保存，都应该进行检测。当然，如果细胞不大对劲，应立马检测。
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检测频率是一方面，选择合适的检测方法也很重要。到底是PCR、生化分析、ELISA还是免疫荧光呢？PCR应该算是检测支原体的理想方法，它综合了几个优势：灵敏、特异、快速、廉价等。细胞培养上清可直接用来检测，非常方便。Sigma-Aldrich公司的LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit，扩增的就是支原体基因组上16S核糖体RNA基因。此区域高度保守，因此可检测多达19种支原体。当然，为了避免假阳性和假阴性，实验中必须设立多种对照：阳性对照、阴性对照和内对照。如果电泳图上出现259bp的清晰条带，对不起，你中招了。以色列Biological Industries（BioInd）公司的EZ-PCR Mycoplasma Test Kit也能提供支原体的快速检测，引物与Sigma类似，也是扩增16S rRNA。这个试剂盒的灵敏度颇高，M. capricolum的检测极限为5.5 CFU/ml，M. hyorhinis则为10.5 CFU/ml。
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Stratagene新的MycoSensor QPCR Assay Kit通过实时定量PCR的方法来检测最低10个拷贝的支原体，连跑胶的时间都省了，整个过程只需要2小时。阳性PCR产物的Tm值为85C，而内对照为82C，通过熔解曲线分析能将两者区分开。另外，Stratagene也提供了PCR检测支原体的试剂盒。
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如果你对杂交过程得心应手，还可以选择R&D公司的MycoProbe Mycoplasma Detection Kit。它利用标记了碱性磷酸酶的寡核苷酸探针与16S 核糖体RNA杂交，随后用显色底物就能了解支原体的存在。整个过程只需4.5小时，也还算快，能检测8种最常见的支原体。
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用Hoechst 33258染料检测支原体是很多教科书推荐的方法。由于支原体含有DNA，能与Hoechst 33258染料结合，在500倍放大情况下，表现为细小颗粒或纤毛染色。但操作过程较繁琐，且需要一定的经验来辨别支原体，新手可能不大容易掌握。
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拯救细胞
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如果很不幸，你的细胞已经感染了支原体，怎么办？大部分人的想法可能都是把感染的细胞扔掉，重新开始。一旦感染了支原体，细胞完全复原的机会很小。所以在液氮中多储存一些备份还是比较明智的选择。
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如果你的细胞非常稀有且珍贵，那只能去奋力抢救了。拿什么拯救你，我的细胞？由于支原体没有细胞壁，且代谢慢，故大部分传统的抗生素都不奏效。只有三类抗生素能有效对付支原体，它们分别是：四环素、大环内酯和喹诺酮。在低浓度时，这些抗生素不会产生耐药性，且对哺乳动物细胞的影响很小。四环素和大环内酯能分别结合30S和50S核糖体亚基，从而抑制蛋白合成。喹诺酮则抑制关键的DNA旋转酶。市场上的一些产品也大多是利用了这些抗生素，在此，生物通给你介绍几种。
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罗氏的BM-Cyclin，包含泰妙菌素（BM-Cyclin 1）和二甲胺四环素（BM-Cyclin 2）两种抗生素。BioInd提供了三种抗生素，BIOMYC-1和2的成分与BM-Cyclin相同，BIOMYC-3成分为氟喹诺酮类的环丙沙星。这三者结合，覆盖了抗生素的三大类，能去除90%的支原体。Invivogen公司的Plasmocin，也是两种抗生素的混合物，能抑制蛋白合成和DNA复制。MP Biomedicals （以前是ICN）提供的Mycoplasma Removal Agent（MRA）则是喹诺酮的衍生物。
不过这些抗生素也不是万能的，没有一种抗生素能去除全部支原体。一开始你可以尝试使用某一种，如果不奏效的话，则可以同时或接连使用两三种。据细胞培养专家介绍，平行使用两种类型的治疗会比较好，例如BM-Cyclin + 喹诺酮或BM-Cyclin + Plasmocin，至少其中一种会成功。不过不要反复使用同一类型的化合物，如喹诺酮的多种衍生物，那样有可能导致抗药性，效果反而不好。生物通 cuturl('www.ebiotrade.com')

Sigma-Aldrich公司也推出了一种非抗生素的LookOut Mycoplasma Elimination Kit，具体原理不太清楚。据Sigma称，第一步用这个试剂盒能清除大部分支原体污染，第二步再用抗生素对付残留的支原体，效果非常好。如何确定治疗效果呢？治疗后用无抗生素的培养基培养两周，再进行检测。生物通 cuturl('www.ebiotrade.com')

重在预防生物通 cuturl('www.ebiotrade.com')

虽说支原体可以铲除，但这种劳力劳心的事情估计没人愿意做，那么平时的预防更重要。生物通最近还发现了几种好东西，能预防支原体。以色列BioInd公司有一种抗支原体喷壶，每两星期对实验室物体表面（如门，窗，二氧化碳培养箱内外等）喷洒，能有效防止支原体污染。Sigma也有一种LookOut DNA Erase的喷雾，能在60秒内彻底破坏DNA。而水池(二氧化碳培养箱蓄水槽，各种水箱，及清洗用水池等)是支原体污染中最难处理的地方。BioInd独创了专门针对水池的系列产品，只需加入少许，就能轻松对付。需要特别提及的是，液氮罐中也可能有支原体。支原体能耐受液氮的低温，虽然不会增殖，但会污染你的细胞。因此，细胞冻存管还是不要放在液氮内，以免液氮渗漏进入细胞，而是储藏在液氮的气相中。生物通 cuturl('www.ebiotrade.com')

不过，预防支原体的最佳方法还是良好的细胞培养技巧和正确的态度。虽然这些都是老生常谈，但一旦熟悉了细胞培养，就很容易麻痹大意，时常敲敲警钟还是相当必要的。