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利用核酶技术切割肿瘤多药耐药基因(MDRl)，逆转肿瘤抗药性。方法  按照锤头结构模型设计、合成了核酶196MDRl(196 RZ)，并定向克隆人包含RNA多聚酶Ⅲ启动子的逆转录病毒载体中。通过脂质体介导，将抗mdrl核酶表达质粒(N2A+tRNAmet-iMDRl-Rz)导入人肝癌耐药细胞株HepG2。分别采用RT-PCR、荧光PCR、蛋白质印迹分析(western blot)、流式细胞仪检测术、罗丹明聚集及MTT方法，观察细胞的RZ、mdrl mRNA、P糖蛋白(Pgp)表达和对化疗药物敏感性的变化。结果  经抗MDRl核酶处理的耐药HepG2细胞，RZ稳定表达，MDRl mRNA、Pgp明显降低，细胞内罗丹明聚集，对阿霉素的敏感性提高200倍。结论  针对多药耐药基因mdrl的核酶可明显降解mdrl mRNA，抑制Pgp的表达，具有强大的逆转肝癌耐药细胞HepG2多药耐药的作用。

    [关键词]  肝肿瘤；P-糖蛋白；多药耐药性

    肝癌的多药耐药性(multidrug resistance，MDR)严重影响着肝癌的化疗效果和预后。而传统的MDR逆转剂是作用在P糖蛋白(pglycoprotein，Pgp)水平，效率低，副作用大。核酶(ribozyme，RZ)是可作用于靶mRNA的具有催化活性的RNA，Ayre等[1]提出了锤头结构模型并利用锤头状核酶在体外或细胞内特异性切割mRNA，阻断基因的表达。随着分子生物学发展，尤其是对核酶的研究为肝癌MDR的逆转提供了新的策略。核酶通过碱基配对，特异地与靶mRNA结合，并切割分解靶mRNA。其突出的高效率、高特异性、少副作用，被誉为分子剪刀，为从基因水平逆转MDR展示了良好的前景。本研究旨在探讨用这一先进技术来逆转MDR的可能性。

    材料与方法

    1．细胞模型的建立：人肝癌耐药细胞系HepC2，由华中科技大学同济医学院肝脏外科中心实验室建株。在37℃、5％CO2条件下，以含10％小牛血清、青霉素(100 U／ml)、链霉素(100 μg/ml)的RPMI1640培养液中进行细胞培养和传代。     2．核酶的构建和克隆人载体：核酶质粒由日本Hiroyuki Kobayashi博士惠赠。用限制性内切酶BamHI and StuI，将包含△3′-5′mutant humantRNAimet，基因的500 bp的DNA片段从phH2D△3′-5′质粒中抽提出来，并将之克隆人含3′长末端重复的N2A载体上的SnaBI位点。设计为N2A+tRNAimet构建质粒N2A+tRNAimet-iMDRl-Rz，通过转染大肠杆菌DH5α纯化抽提质粒(Promaga，质粒抽提试剂盒)，转染GP+envAMl2细胞用以病毒包装。

    3．HepG2细胞的转染和筛选：取6孔培养板，每孔接种约8×104**HepG2细胞，细胞生长汇合达70％时开始转染。质粒DNA20μg，脂质体10μl，孵育时间6 h。分别设置转染组(A组)和未转染组(B组)。待转染细胞生长72 h后，细胞接近融合时，按1：3密度传代；继续培养至细胞密度达80％融合时，加浓度为80μg/ml的G418培养液进行筛选，以未转染的细胞做筛选对照。当对照细胞绝大部分死亡时，再更换一次转染细胞的筛选培养液(浓度为800 μg/ml)，2d后，将G418浓度降至400μg/ml维持筛选；3周后可见抗性克隆形成，消化收集克隆后继续培养待测各种指标。

    4．RT-PCR检测MDRl  mRNA表达：采用TRIZOL试剂提取细胞总RNA，-70℃保存备用。除特别标明的试剂外，均使用Promega公司的RT／PCR试剂盒。以MJ公司PTCl00型PCR仪作热循环：预变性94℃2 min；循环：94℃30s、57℃ 45s、72℃ 60s，共35个循环。循环后延伸72℃ 5 min。PCR后，以2％琼脂凝胶电泳检测扩增结果；GDS8000型凝胶成像分析系统对目的DNA条带扫描，确定其光密度值，将MDRl与β-actin比值作为MDRl表达水平的参数，对MDRl产物相对定量。MDRl与β-actin的引物设计参照基因库，运用引物设计软件自行设计。

    5．定量RT-PCR：(1)仪器：美国ABI PRISM7700扩增仪；上海久盛公司提供ABI PRISM 7700微量荧光检测仪及数据处理软件。(2)试剂：由上海久盛公司提供DNA荧光定量试剂盒。(3)方法：遵照仪器及试剂盒使用说明进行样本检测。引物及探针设计根据基因库，运用引物设计软件自行设计。斑点杂交法报告阴、阳性结果；FG PCR以N+4／5(P1N)为判断标准(N为空白对照之荧光强度，Pl为102COPY／ml阳性质控品之荧光强度)，样品荧光强度小于该标准为阴性，大于该标准为阳性，并通过曲线获得DNA含量。

    6．蛋白质印迹分析：收集细胞以冷PBS清洗2次，以裂解缓冲液[50 mmoL／L Tris cl(pH=8.0)，120 mmol／L  NaCl，0.2  mmol／L  EDTA，1 mmol／LPMSF和1％NP40]提取总蛋白，取150μg总蛋白上样进行SDS PAGE电泳，通过电转移法将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素滤膜上，氨基黑染色30s，10％乙酸脱色。加入封闭缓冲液室温振荡1 h，将膜放入溶有鼠抗人Pgp、MRP、LRP蛋白单克隆抗体(1：1000稀释)的新鲜配制封闭液4℃下振荡2h，漂洗后滴加羊抗鼠IgG，ECL曝光显色。

    7．细胞对R123的蓄积作用和外排测定：l×109／L单细胞悬液，加入2.5 mg/L的荧光染料R123，37℃ CO2培养箱中培养45 min后，用PBS漂洗2次(1500r/min，3min)，取250μl用作R123蓄积测定，试管内余液加培养液，37℃培养45 min，取250μl作外排测定，在λex=488 nm、λem=525 nm处测定R123荧光强度，每个样品测定约104个细胞。     8．细胞药敏试验(MTT试验)：将细胞数调整至3×104／ml，取96孔板，每孔加入200μl细胞悬液，培养箱中过夜；去掉培养液，加入用1640配制的不同浓度的阿霉素溶液(每m;分别含0.00001μg，0.0001 μg，0.001 μg，0.0l μg，0.1 μg，l μg，10 μg，100μg)，200μl／孔，细胞培养箱中48 h后，每孔加入MTl20 μl(10mg/ml)，保温4h。弃上清，加入二甲亚砜200 μl／孔，酶标仪上测出550 nm值，算出ID50并做图。

    9．激光共聚焦检测核酶转染细胞的凋亡：收集细胞，PBS漂洗2-3次，生理盐水调整细胞密度为l×lO／ml的细胞悬液，将细胞涂于预先涂有多聚赖氨酸的载玻片上，吹干，用新配制的40g/L多聚甲醛室温下固定30 min，宝灵曼公司生产的细胞凋亡原位检测试剂盒进行检测，Bio-RadMRC-1024激光共聚焦显微镜观察，每张玻片选取3个视野进行荧光强度的定量分析，结果以灰度值表示。