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摘要

RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是由双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)引发的转录后基因静默机制. RNAi是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制. 目前已成功用于基因功能和信号转导系统上下游分子相互关系的研究，有可能为肿瘤基因治疗提供新策略.


任玥欣, 宋于刚, 陈学清. RNAi研究进展. 世界华人消化杂志  2004;12(3):748-750

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0  引言

RNAi (RNA interference )即RNA干扰，是1998年由Fire首次发现并命名的转录后水平的基因静默，是美国《Science》和《Nature》评出的2002年度最重要的科技成果之一，正成为基因功能研究和基因治疗研究的热点. 1995年，康奈尔大学的Guo和Kemphues et al [1]利用反义RNA(antisense RNA)技术特异性地阻断秀丽新小杆线虫(C. elegans)中的par-1基因的表达以期得到与对照组注射正义RNA(sense RNA)相反的结果，但最终的结果却令他们费解:二者同样阻断了par-1基因的表达途径. 直到1998年，Fire et al [2]的研究证明，在正义RNA也阻断了基因表达的试验中，真正起作用的是双链RNA. 这些双链RNA是体外转录正义RNA时生成的. 这种双链RNA对基因表达的阻断作用被称为RNA干扰(RNA interference，RNAi). 随后的研究发现，RNAi现象在多种生物中存在，如线虫，果蝇，斑马鱼，真菌以及植物等. 生物体可利用RNAi来抵御病毒的感染，阻断转座子的作用[3].

        到1999年Tuschl et al [4]报道在哺乳动物中也存在RNAi，只是导入的RNA是小干扰RNA (siRNA); 2001年Berstein et al提出: 只有22核苷酸(nt，nucleotide)才能特异性地阻断dsRNA，同时他们还发现了体内一个分解dsRNA为siRNA的叫Dicer的酶[5]. 近几年来RNAi的研究取得了很大进展，他被《Science》杂志评为2001年的十大科学成就之一. 2002年RNAi的研究又有了新的突破，发现他在基因表达调控中发挥重要作用，他也名列2002年《Science》杂志评的十大科学成就之首.


1   RNAi的机制 RNAi的机制可能是细胞内双链RNA在Dicer酶的作用下，可形成-22 bp大小的小干扰RNA(small interfering RNAs，siRNAs)，siRNAs可进一步掺入多部分核酸酶(multicomponent nuclease，RISC)并使其激活，从而精确降解与siRNAs序列相同的mRNA，完全抑制了该基因在细胞内的翻译和表达.

        RNA酶Ⅲ是一种能切割双链RNA的酶，参与RNAi反应的Dicer酶是RNA酶Ⅲ家族的一个成员. Dicer酶广泛存在于蠕虫、真菌、物及哺乳动物体内. 他的结构中包括一个螺旋酶结构域，两个RNA酶Ⅲ结构域，一个双链RNA结合位点. 在Dicer酶的作用下，双链RNA被裂解成21-23个核苷酸的siRNA，他启动了细胞内的RNAi反应[5]. 因少量双链RNA即能阻断基因表达，且此效应可传至子代细胞，研究者们推测细胞内存在RNAi效应的扩增系统. 研究者们发现，在真核细胞中也存在能以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶(RNA-directed RNA polymerase，RdRP). 在RdRP 的作用下，进入细胞内的双链RNA通过类似于PCR的反应过程，呈指数级的数量扩增. 双链RNA进入细胞后，一方面在Dicer酶的作用下被裂解成小片段siRNA，另一方面在RdRP的作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA. 小片段siRNA生成后与核酸酶形成复合物，随后mRNA与小片段的正义链置换，被mRNA替代. mRNA的位置与最初正义链的位置相同，从而被核酸酶在相同的位点降解. 更有意义的是mRNA的降解使核酸酶得以再生，这样周而复始，mRNA得以降解，因此RNAi呈酶解动态[6].

        由于mRNA也以21-23 nt的特定间隔降解，因此认为降解dsRNA与mRNA的核酸酶相同. 另一方面以SiRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链. 结果mRNA也变成了双链RNA，他在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA. 这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制[4-5]. RNAi不同于其他基因阻断技术，他是转录后水平的基因静默机制，因此注射该基因的内含子或者启动子顺序的dsRNA都没有干涉效应. RNAi具有较高的特异性，能够非常特异地降解与之序列相应的单个内源基因的mRNA，且抑制基因表达效率很高，相对少量的dsRNA就可以使表型达到缺失突变体程度，但dsRNA需要一个最小的长度才能产生有效的干扰效果. dsRNA小片段如小于21-23 nt (如10-15 nt)，特异性将显著降低，不能保证不与细胞内非靶向基因相互作用，如远远大于21-23 nt，互补序列可能延伸，超出抑制范围. RNAi基因表达的效应可以突破细胞界限，在不同细胞甚至生物体间长距离传递和维持，并可传递给子一代[6].


2   RNAi在细胞中的研究和双链RNA的构建

2.1 Billy et al [7]的研究表明: 在小鼠的胚胎细胞中也存在RNAi . 将727个碱基对的双链RNA转入小鼠的畸胎瘤细胞，诱发了细胞内的RNAi机制，并抑制了报告基因的表达. 但大于30个核苷酸的双链RNA进入哺乳动物的成体细胞后，会非特异的阻断基因的表达. 因为长的双链RNA进入哺乳动物成体细胞后，细胞内的病毒防御机制被激活; 且RNA酶L(RNase L)被激活，产生非特异的mRNA降解. 而未分化的胚胎细胞中，上述防御病毒的机制存在缺陷，因而双链RNA能特异的阻断基因的表达. 但Tuschl et al [8]人的研究克服了这一障碍，他们发现，21个核苷酸的双链RNA能够诱发哺乳动物细胞内的RNAi机制，同时不会激活细胞内的干扰素. 他们合成了以荧光素酶的mRNA为靶分子的21个核苷酸的双链RNA，将他和荧光素酶的表达质粒用脂质体共转染到NIH3T3，COS-7，Hela S3，293细胞中，报告基因的表达被抑制了90%. 由于报告基因得到的结果不能完全说明细胞内的情况，他们又合成了细胞内源性基因laminA/C为靶目标的双链RNA，这个双链RNA也特异的抑制了laminA/C的表达，抑制率达到90%以上.

2.2 双链RNA的构建  双链RNA可先在体外构建好，用脂质体转染细胞. 但有些细胞脂质体转化效果差，转化到细胞内的双链RNA半衰期短. 而先在体外构建能表达双链RNA的载体，再将载体转到细胞内合成出双链RNA，不但能增加有效转染细胞的种类，而且在长期稳定表达载体的细胞株中，双链RNA能够长期发挥阻断基因的作用. 构建双链RNA表达载体，使用RNA多聚酶Ⅲ指导RNA的合成. 因为RNA多聚酶Ⅲ有明确的启始和终止序列，当RNA多聚酶Ⅲ遇到连续5个胸腺嘧啶时，他指导的转录就会终止，且转录产物在第二个尿嘧啶处被切下来，因此合成的RNA无polyA尾. U6启动子能被RNA多聚酶Ⅲ识别，合成出RNA. Sui et al [9]用Bluescript作为载体，RNA多聚酶Ⅲ可识别的U6作为启动子，从绿色荧光蛋白(GFP)的基因上选择了一个21个核苷酸的片断(片断1)，将其插入到Bluescript载体中. 然后合成出片断1的反向重复序列，并在其后加了5个胸腺嘧啶，称为片断2. 他们将片断2接到Bluescript载体中片断1的后面，将载体转移到细胞中后，转录出的RNA由于具有回文序列，会形成一个发卡样结构，从而得到了双链RNA. 片断后面加了5个胸腺嘧啶，RNA转录到这个位置时就会终止. 而且转录出的RNA形成发卡样结构后，会在3’端形成2个突出的尿嘧啶，这类似于天然的siRNA，因而有利于双链RNA诱发RNAi. RNA多聚酶Ⅲ亦识别H1-RNA 启动子. 在H1-RNA 启动子后面接上能形成发卡样结构的反向互补序列，将此载体转入细胞后也能在细胞内合成dsRNA[10]. T7也可作为启动子合成dsRNA. 将PCR产物用NotI酶切后自身连结，回收正向片断和反向片断连结形成的具有反转重复序列的片断，接到pGEMTeasy载体上，就构建成了可以表达dsRNA的载体. 用此载体可先在体外合成dsRNA，或将其转入到细胞内合成dsRNA. 在后一种情况下，还须将能表达T7RNA多聚酶的载体也一起转入到细胞中，以提供能识别T7启动子的RNA多聚酶[11]. 腺病毒是体内转基因的常用载体. Xia et al [12]用腺病毒做载体，在体内和体外表达dsRNA，并成功的阻断了基因的表达.