表观遗传学

浅谈microRNA的生物学功能---miR-122在肝脏发育和肝癌发生过程中的作用

1993年，Victor Ambros实验室（Harvard University）的Rosalind C. Lee（这位不太会讲中文的华裔女士后来成为Ambros的夫人了。呵呵）等在研究秀丽隐杆线虫(C. elegans)发育时，首次发现lin-4基因的终产物是一个长22个核苷酸的小RNA，它的突变导致线虫胚胎发育时序出现异常[1]。由于当时这种小分子的发现是个特例，因此在当时并未引起人们的注意。直到2000年，Gary Ruvkun实验室（Massachusetts General Hospital）发现了第二个类似的小分子RNA，let-7[2]。最而令人们惊奇的是，尽管它这么小，却在线虫到人类之间广泛的动物种类中保守存在，因此引起了科学家们的极大兴趣[3]。2001年，science同一期接连三篇文章报道不同国家的3 个研究小组在线虫(C. elegans)、果蝇(D. melanogaster ) 和人（HeLa细胞）cDNA文库中鉴定出近100个与lin-4和let-7相似的长度为21～22 n t的小分子RNA，并统一命名为microRNA (miRNA)[4-6]。
miRNA具有几个鲜明的特征[4]：第一，绝大多数成熟miRNA的长度在22个碱基左右。第二，具有60-70nt长的发夹前体结构，这是dicer识别和切割形成成熟miRNA的必需条件。第三，进化上保守性极强，近缘物种中序列几乎一致。第四，基因座位位于基因间隔区或蛋白质基因的内含子中。根据这些标准，从2001年到2005年，国际上很多实验室投入到miRNA的克隆鉴定工作，在高等动植物细胞、人类病毒中都发现了miRNA的存在，到2005年底的时候，miRNA的数量已经达到3400多种。后来，随着高通量测序技术的发展和应用，科学家们借助于大规模测序使这个数字迅速翻了几番，到现在为止，已经在167种动植物和26种病毒中发现了miRNA[7]；miRBase中收录的人类miRNA基因已经有1600个，可形成2042个成熟miRNA分子[7]。因此， miRNA数量之庞大、分布之广泛可见一斑。
不同于其它小分子RNA的发现， miRNA在被发现的时候就已经知道了它的生物学功能。从发现它那天起，miRNA的功能就与胚胎发育紧紧地联系在一起。早期的遗传学研究证明lin-4 和let-7基因的突变都会造成线虫发育时序异常[8]；斑马鱼胚胎发育过程中115种脊椎动物保守的miRNA的表达谱分析表明，几乎所有的miRNA都随着胚胎发育的过程中而变化，68％的miRNA呈现出高度的组织特异性表达模式[9]；而对很多miRNA的研究都证实它们在器官的发育和细胞分化过程中发挥关键作用，甚至决定着细胞的命运[10]。
miRNA之所以引起全世界的关注，还有一个重要的方面就是他跟各种人类疾病有关，特别是肿瘤。表达谱研究发现在各种肿瘤中都有大量miRNA失调，或表达升高，或表达下降，同时失调的miRNA种类具有很典型的组织来源特异性[11]；而功能研究表明这些失调的miRNA发挥着癌基因或者抑癌基因的功能，在癌症的发生发展过程中扮演重要角色[12]。因此，miRNA不仅可以作为诊断肿瘤的标志物，同时也可成为潜在的治疗靶标和药物靶点。

如何理解生理过程和病理过程中miRNA发挥的作用之间的关系呢？

请高手解释

举个我们研究的例子来详细说明其中的奥妙。
miR-122是最早发现的组织特异性、高丰度表达的miRNA之一，它的表达占所有肝脏miRNA表达量的70％，而在其它组织中几乎检测不到[13]。它进化上非常保守，从鱼类到人类之间的物种中都保守存在。研究发现miR-122的表达随着小鼠胚胎发育过程在肝脏中逐渐激活。后来发现它在肝细胞肿瘤（HCC）中普遍下调[14]。研究证明它可以促进HCV的转录[15]，调节脂类代谢[16]。然而，对于其在正常动物肝脏发育过程中的功能并不清楚，同时对于它在肝癌中为何下调表达，有何重要意义也不太明确。
首先，生理状态下（胚胎发育）miR-122的功能是什么呢？我们分析了miR-122的表达特征与肝脏胚胎发育过程之间的关系，发现miR-122的激活表达恰好与肝细胞成熟分化的过程在时间上基本吻合：miR-122的表达起始于胚胎发育的第12.5天（e12.5），随后表达迅速升高，在出生前后达到一个平台期；而小鼠胚胎发育研究表明，大约第13天（e13）开始，肝母细胞（hepatoblasts）开始分化，临近门静脉的肝母细胞经过一个胆管重构（ductal plate remodeling）的过程逐渐形成胆管，而远离门静脉的肝实质内的细胞逐渐分化成为成熟的肝细胞，这一过程在出生前基本完成[17]。鉴于miR-122在肝细胞内表达，我们推测miR-122极有可能在肝细胞成熟分化的过程中发挥重要作用。
如何入手呢？可能大多数人会觉得，先寻找miR-122的靶基因是最好的。但我们却恰恰反其道而想之：是什么机制赋予miR-122在肝脏中特异性表达？又是什么机制调控它在肝脏发育的过程中逐渐激活呢？只要搞清楚什么蛋白（转录因子）调控着miR-122，那么就可以顺藤摸瓜，推测出miR-122的功能，然后再从Targetscan、PicTar等预测的上百个候选靶标中寻找相应功能的基因，这样做起来就容易多了。

话说回来，尽管miR-122发现已有多年，但没有人研究它的表达调控，我们当时觉得也很奇怪，这不是一个很好的机会吗！
为了阐明miR-122在肝细胞内的表达调控机制，我们首先寻找可能参与miR-122体内转录调控的转录因子。众所周知，通常组织特异性表达的基因都受到组织特异性表达的转录因子的调控，因此我们推测miR-122的表达可调控也不例外。之前的研究表明肝脏高丰度转录因子（liver-enriched transcription factors，LETFs)的家族成员，如肝细胞核因子（HNFs）和CCAAT/增强子结合蛋白(CCAAT/enhancer-binding proteins, C/EBPs)等在肝脏发育和肝细胞特异性蛋白基因的表达调控中发挥关键作用[18]。因此我们大胆地推测，它们可能直接调控了miR-122的转录。至于最终选择C/EBPα、HNF4α、HNF1α、HNF3β开展研究，是因为我发现它们在小鼠和人的肝脏中表达水平都比较高。
验证工作非常简单，也非常顺利[19]：（1）无论是在小鼠胚胎肝脏样品中，还是人肝癌（HCC）细胞株中，这四种转录因子的表达与miR-122的表达都具有非常显著的正相关性。（2）我们用5’RACE鉴定了人和小鼠miR-122基因的转录起始位点，并在预测的启动子片段中发现有以上四种转录因子的结合motif。（3）利用luciferase报告基因及突变分析，我们发现启动子片段中存在HNF4α，HNF1α，HNF3β的结合位点，而C/EBPα的结合位点在miR-122基因内部。（4）ChIP和EMSA实验都证明体内四种转录因子可以结合在预测的位点。（5）在低表达miR-122的细胞中过表达转录因子可以诱导内源miR-122表达激活。
接下来，我们要问，miR-122是否、如何调控肝脏的发育呢？回答这个问题就是要找到miR-122的生物学靶标。在胚胎发育和器官形成的过程中，细胞增殖与分化是两个最核心的细胞行为。已有研究表明四种LETFs在胚胎发育过程中都促进肝母细胞向肝细胞分化，抑制肝母细胞的增殖。因此我们就选择那些可能具有抑制分化或促进增殖的蛋白基因作为候选靶标。很快，我们从Targetscan 4.2预测的结果中选取了11个未证实的候选靶基因，lucifease报告基因实验证实，其中有9个都受到miR-122的显著抑制（下降30% 到 70%），而且这种抑制是miR-122靶位点依赖的；qRT-PCR结果显示所有这些基因在胚肝中都表达，大多数表达还比较丰富，表明它们很有可能是miR-122体内的靶基因[19]。
再接下来就是挑一个最具有代表性的靶基因进行功能验证了。我们一眼就相中了CUTL1，原因有三：（1）报告基因实验中受miR-122抑制最显著；（2）所有靶基因中它的靶位点最保守；（3）它是转录抑制因子，在很多细胞类型中（包括肝细胞）抑制决定终末分化的基因的表达[20]。验证工作也很顺利[19]：（1）WB结果表明CUTL1蛋白的表达恰好与miR-122的表达呈负相关，肝脏发育过程中及肝癌细胞株中都是如此。（2）过表达和抑制实验都表明miR-122在转录后抑制CUTL1的表达。（3）在HepG2中稳定表达miR-122可以抑制细胞增殖，而且可以激活成熟肝细胞功能性基因的表达，包括CUTL1下游基因CYP7A1。
通过以上的研究过程，我们得到了这样的一条通路：LETFs－miR-122－CUTL1[19]。而我们再回头思索miR-122的生物学功能时，便觉得顿时恍然大悟：原来在这条通路的两头都是决定肝细胞命运的转录因子，而miR-122起到了桥梁和传递信号的重要作用[19]。打个比喻吧：CUTL1的作用是压制决定终末分化的基因的表达，可谓一夫当关，万夫莫开；LETFs调动千军万马，来势汹汹；miR-122就是先锋官，拿下CUTL1，终末分化的大局便已定。
那么肝癌中miR-122的下调作何解释呢？现在看来再明显不过了。我们前面在做表达检测时就发现，在所有4株肝癌细胞中，LETFs的表达相对于肝脏组织都有极显著下调，比如HepG2细胞中，四种LETFs的表达最高只有成鼠肝脏的千分子二，可见miR-122的普遍下调主要是由于调控它的转录因子的低表达引起的[19]。那么miR-122的普遍下调对于肝癌形成有何意义呢？miR-122是肝细胞分化的重要信使，它的异常表达自然影响肝细胞的正常分化，而细胞不能正常分化不就是肿瘤细胞的典型特征吗[19]！（2012年8月，有两篇文章一起在JCI上发表，首次用knockout的证据表明miR-122的缺失可导致代谢异常、炎症、肝肿瘤发生[21, 22]，强有力地支持了以上观点）
以上这个例子，其实还可以进一步推而广之。前面我们提到，在胚胎发育过程中绝大多数miRNA呈现组织特异性表达激活的模式，它们的功能是调控细胞的分化和器官的形成；由于促进细胞分化的特性，多数miRNA在肿瘤中发挥抑癌基因的作用，因此，在各种肿瘤中普遍下调表达也是理所当然。我想这正是生理过程（胚胎发育和细胞分化）和病理过程（肿瘤发生）中miRNA发挥的作用之间的联系。

后话：
近年来，在高等生物细胞中发现了数目庞大的非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA），它们是遗传信息表达调控体系中不可或缺的成员。每一种非编码RNA的发现都为我们揭示一个新的细胞分子机制。小RNA如microRNA、small interfering RNA（siRNA）的发现揭示了细胞中广泛存在的转录后基因表达调控机制。虽然当下我们还没搞清楚长非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）究竟怎么分类，但大量研究已表明它们通过多种多样的机制调控着基因组的遗传和表达。还有那些发现和功能解析工作正在如火如荼进行的非编码RNA类群，如： PIWI蛋白结合小RNA（piRNA）、启动子相关小RNA（PASR）、转录终止位点相关小RNA（TASR）、增强子相关小RNA（eRNA）、tRNA衍生的小RNA（tRF）、重复序列相关小RNA（rasRNA）等。我们相信每一种非编码RNA都以它特有的调控方式发挥着重要的生物学功能，高等生物的复杂性或许就隐藏在这庞大的非编码RNA阵营中。