表观遗传学

表观遗传学成为耗费无数博士五年（或者是八年？）的“热门领域”大致是上世纪九十年代以来的事，但epigenetics一词的诞生则需追溯到七十年以前了。在1942年， Conrad Hal Waddington把gene和epigenesis（渐成说）两个词合而为一，提出了所谓epigenetics的概念。在这个时代，DNA是遗传物质的概念远没有确立，基因的本质仍是未知之谜，Waddington用epigenetics这个抽象的概念来描述基因和它所处的环境相互作用，从而构成表现型（phenotype）的过程。时光流逝，已是1990年， Robin Holliday把epigenetics重新理解，定义为“研究在复杂生物发育过程中，基因表达的时空特征是如何被调控的学科”。到了今天，人们对epigenetics这个词的普遍理解则又与Holliday的当年有很多不同，教科书中说它是“研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达了可遗传的变化的一门遗传学分支学科。”

看过epigenetics定义的演化过程，如果稍加总结便不难发现，人们对epigenetics或者epigenetic inheritance的兴趣，大抵可以被划分到两个层面。其中一层在于个体发育过程中。哺乳动物有200~300种不同种类的细胞，除少数特例，所有细胞使用相同的遗传信息（genetic information），而具有各异的基因表达特征。这种基因表达特征被认为是由表观遗传信息（epigenetic information）赋予的。特定细胞株系的基因表达在有丝分裂周期中得到继承，这便是mitotic epigenetics inheritance。与前者相对应，人们的另一层兴趣在于个体世代间的表观遗传信息继承，即miotic epigenetic inheritance。表观遗传信息会以一些目前尚未确知的方式储存于配子中，传递给下一代。

世代间的表观遗传是永远能引起人们兴致的话题，倘追根溯源，甚至可以挖出拉马克学说。Jean-Baptiste Lamarck 认为生物个体为适应环境做出的努力是物种进化的推动力，个体在生命周期中会获得适应外部环境的性状，并且遗传给它们的后代。作为曾被彻底推翻的观点，拉马克遗传在近些年被重新认识。这在一方面是源于一些非基因组的行为遗传现象的发现（吐槽：尽管这些证据看起来有些令人担忧）。另一方面，一些原有的世代间的表观遗传现象（例如植物和其他一些模式生物中发现的隔代遗传现象），以及为这些现象提供支持的机理方面的发现（如Stella蛋白保护卵细胞基因组中部分DNA甲基化逃脱重编程；又如植物通过小RNA实现的表观遗传信息的隔代传递）也都引起人们的注意。这部分工作非我们的研究领域，在此便不班门弄斧加以讨论。

再来说mitotic epigenetic inheritance。在1960年代到1970年代，人们在对果蝇发育方式的一系列研究中发现，即便在生活的微环境改变并且经历过多次分裂，细胞仍旧可以记忆它们的命运（cell fate）。例如，果蝇幼虫的成虫盘（imaginal disc）可被离体（in vitro）培养，其细胞增殖而不分化。有趣的是，当这些体外培养的细胞被移植回果蝇幼虫体内后仍可正确分化（Hadorn, 1968）。这样的发现说明，细胞可以记住自身的特征，并具有在细胞周期中将这些特征传递给子代细胞的本领。

时至今日，研究者们普遍接受，包括组蛋白修饰在内的表观遗传信息，对基因表达模式在亲代与子代细胞之间的保持具至关重要。那么，组蛋白修饰特征是如何被传递的呢？这要从组蛋白的合成与组装讲起。

在有丝分裂周期中，想要使表观遗传信息得到保持，最大的挑战便是克服每一轮DNA复制带来的稀释作用。DNA聚合酶通过核小体时，核小体的结构解聚，原先的表观遗传修饰特征被打破。之后，旧的组蛋白在新生成的DNA链上重新组装。与此同时，新组蛋白的合成紧密伴随着DNA的复制而发生（Marzluff et al, 2008）。新的组蛋白迅速装配入复制后的DNA，从而弥补旧有组蛋白之间的空隙。新合成的组蛋白是极少带有修饰的，因此，原先的组蛋白修饰模式在DNA复制过程中被稀释。为了保证染色质修饰的可靠继承，生物体必须进化出一套精细的工作机制，使旧组蛋白的重新利用与新合成组蛋白的装配妥善配合。

生物需要进化出怎样的核小体的组装模式，才能满足表观遗传继承的需要呢？当然，首先是使表观遗传信息可以被继承。这要求核小体在DNA复制时的解聚、重组行为符合两条标准。第一，当核小体在复制叉前方解聚后，旧组蛋白，尤其是(H3-H4)2核心四聚体必须保持在原先所在的基因组区域（显然，如果组蛋白在一处解聚后，可以漂到基因组的任意地方，就谈不上修饰的继承了）。第二，要想使组蛋白修饰得到继承，就需要使旧的组蛋白修饰在某种程度上指导新的组蛋白修饰的建立（Xu and Zhu, 2010）。这就要求旧的组蛋白要被随机分配到两条新合成的DNA链上（如果只有其中一边的新生DNA获得旧组蛋白，未获得一方显然会失去旧的表观遗传信息）。有关上述两方面问题的证据，主要来源于1970年代末到1990年代初一系列利用体外复制体系进行的研究工作，在两篇综述文章中可以找到详细总结（Annunziato 2005; Xu and Zhu, 2010）。

接下来的问题是，组蛋白修饰的继承在空间上是否是精确的？核小体组装模式又在这里面具有何种意义？

在过去的三十余年中，有大量文献记录了关于下面问题的讨论：复制叉前方的(H3-H4)2核心四聚体是如何在DNA复制过程中分配到新生DNA链上？全保留模型认为(H3-H4)2以完整的四聚体为单位，转移到新生DNA链上；与之相反，半保留模型认为，旧有(H3-H4)2四聚体解离成为两个二聚体，再分别与新合成的H3-H4二聚体重组。在最近几年，这个看似细节的分子机理却获得了大量关注与讨论，原因是(H3-H4)2四聚体的传递方式对组蛋白修饰的继承具有潜在的重要影响（Nakatani et al., 2004; Annunziato 2005; Groth et al., 2007; Martin et al., 2007; Probst et al., 2009）。如果(H3-H4)2的半保留复制模型是正确的，则为组蛋白修饰的精确传递提供了依据。依此模型，新合成的H3-H4二聚体可以使用与其配对的旧H3-H4二聚体上的表观遗传信息为模板，建立自身的修饰，从而让表观遗传信息在基因组的相同区域精确地重建。与此相反，如果全保留模型是正确的，新合成的(H3-H4)2四聚体需以临近的旧核小体上的修饰为模板，建立自身修饰。显然，这样的组蛋白修饰重建在空间上是不十分精确的。

1970年代中期，核小体的念珠结构被观察到（Olins AL and Olins ED, 1974），核小体的结构模型也被提出(Kornberg, 1974; Kornberg and Thomas, 1974)。仅在此后不久，高瞻远瞩的三位科学家Weintraub, Worcel和Alberts便提出了“核小体半保留复制模型”（Weintraub et al., 1976），用来解释可能存在的位于组蛋白上的遗传信息的复制问题（尽管此时组蛋白修饰的意义尚未被意识到）。

在这之后的十几年中，众多研究却支持(H3-H4)2全保留复制模型。在1980年，Prior等人使用黏菌Physarum作为模式生物，研究了H3-H3相互作用的长期稳定性（Prior et al, 1980）。实验结果显示，即使经历五轮DNA复制，最初的H3-H3相互作用依然存在，证明(H3-H4)2四聚体在数个细胞周期过后依然保持稳定（Prior et al, 1980）。在此十年之后，Jackson使用同位素标记和密度梯度离心的技术对离体培养的哺乳动物细胞中组蛋白(H3-H4)2四聚体的命运进行了研究（Jackson, 1990）。作者得到的结论是，与H2A-H2B的大量置换不同，(H3-H4)2四聚体可以在数轮细胞周期中保持原有组合。Yamasu和Senshu在1990年发表的文章中，利用与Jackson相识的研究方法得到了同样的结论（Yamasu and Senshu, 1990）。

在了最近几年，关于核小体复制模式的讨论波澜再起。一些研究发现H3-H4以二聚体而非四聚体的形式包装入DNA中（Tagami et al., 2004; English et al., 2005; Benson et al., 2006）。晶体学的证据清晰表明，组蛋白伴侣Asf1与H3-H4形成异源三聚体结构，并阻止两个H3-H4二聚体相互结合（English et al., 2005; Benson et al., 2006）。另外，体外实验则证明，Asf1可以打破已然存在的(H3-H4)2四聚体的结构，暗示在体内的DNA复制过程中Asf1可以打破旧有(H3-H4)2的组合，使新、旧H3-H4之间的配对成为可能（Natsume et al, 2007）。这些证据的出现，重新为核小体半保留复制的假说赋予了生命，并在本领域内激起探讨。

想解决这个问题，就需要找到一种办法，使得我们可以选择性地纯化含有“新”或者“旧”组蛋白的核小体，然后定量分析这个核小体里面其他组蛋白的新旧构成。为了实现这样的目的，我们结合了“FLAG-H3诱导表达体系”和“稳定同位素断续标记结合质谱定量”两种实验体系。首先，我们以T-Rex HeLa细胞系为基础，建立了携带不同的FLAG标签标记的组蛋白H3变体的转基因细胞系。FLAG-H3.1和FLAG-H3.3转基因的表达受到四环素（Tetracycline）诱导型启动子的控制。利用这种细胞系，我们可以通过在培养基中添加或撤除四环素，诱导或关闭FLAG-H3.1或者FLAG-H3.3基因的表达。再与细胞周期阻滞实验相结合，便可以将FLAG-H3按实验意图定义为“新”或“旧”组蛋白。另外，我们又在细胞进入S期（组蛋白合成）前后，使用不同稳定同位素标记的赖氨酸（lysine-0或lysine-8）进行培养。这样，“新”“旧”组蛋白又被有不同分子量的同位素赖氨酸标记，从而可以被质谱区分开来。

在第一组实验中，我们首先检验了占体内H3主要部分（~80%）的(H3.1-H4)2四聚体的命运。结果发现已经存在于染色质中的(H3.1-H4)2四聚体在新一轮DNA复制过程中保持完整，这个实验澄清了领域里核小体解离重组模式的争论。使用同样的研究体系，我们进一步将实验延伸到活跃转录染色质区域富集的组蛋白变体H3.3。令我们惊讶的是，在大约两个细胞周期内， 包含FLAG-H3.3的(H3.3-H4)2四聚体中，约有四分之一发生了解离。经过进一步的对照试验，我们认定，所观察到的包含FLAG-H3.3的(H3.3-H4)2四聚体的解离确实在体内发生，而非由于H3.3核小体不稳定，在体外发生重组所造成。与H3.1仅以DNA复制偶联的方式组装入染色质不同，组蛋白变体H3.3既可以DNA复制偶联的形式在S期装入染色质，又可在S期之外以DNA复制不依赖的方式装入。为了验证我们观察到的(H3.3-H4)2四聚体的解离是否由复制不依赖的H3.3组装通路造成，我们使用DNA复制抑制剂HU处理细胞，并检测(H3.3-H4)2四聚体的解离在这种细胞中的发生状况。而我们的结果显示DNA复制的一致可以显著阻止(H3.3-H4)2四聚体解离的发生。

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