表观遗传学

DNA甲基化是哺乳动物基因组中一种非常重要的表观遗传修饰，其主要发生在CpG双核苷酸中的胞嘧啶的第5位碳原子上，由DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase, Dnmt）催化完成，S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl-methionine，SAM）为甲基供体。DNA甲基化并没有改变DNA序列，但对DNA序列所编码的遗传信息的解读具有调控作用。大量的研究证明DNA甲基化在基因印迹、X染色体失活、转座子与逆转座子等寄生DNA的沉默及组织特异性基因的表达调控等主动生理过程中发挥着至关重要的作用。因此，5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine, 5mC）也被形象地称为第五种碱基1-2。

哺乳动物基因组中60%-80%的CpG发生甲基化，且不同组织类型的细胞中发生甲基化的DNA序列也不尽相同，这些甲基化DNA信息的总和被称为甲基化谱式。不同组织类型细胞的DNA甲基化谱式是在个体发育过程中逐渐建立起来的。有意思的是，在个体发育过程中，DNA甲基化谱式会经历两次大规模的重编程过程，一次发生在从受精至着床的早期胚胎发育时期，另一次发生在配子发生过程中3-4。这两次重编程都涉及了基因组范围的主动去甲基化反应（global demethylation）及组织特异的DNA甲基化谱式的再建立（remethylation）。相对于基因组范围内的大规模主动去甲基化，在体细胞中会发生局部的、高度位点特异性的主动去甲基化5-6。我们知道DNA甲基化是由DNA甲基转移酶催化完成，那DNA去甲基化是如何完成的呢？也存在类似于DNA甲基转移酶的DNA去甲基化酶(DNA demethylase)，抑或是其它间接的机制呢？这个问题一直困扰着表观遗传领域的研究人员。

著名的华人生物学家、美国科学院院士朱健康教授及其同事在拟南芥中的开创性研究发现一种由DNA 糖苷酶（DME、DML2、DML3和ROS1等）介导的主动去甲基化机制。ROS1等可以特异性地识别并切除5-甲基胞嘧啶，进而启动碱基切除-修复途径（base excision repair, BER）完成DNA去甲基化5。但在哺乳动物中并没有鉴定到这些糖苷酶的同源蛋白，提示哺乳动物中可能存在不同的DNA去甲基化机制。由于哺乳动物DNA主动去甲基化事件只限于卵子受精后分裂前和生殖细胞生成过程，时间窗口很短，细胞来源非常有限，无法获得足够数量的细胞或组织进行常规的分子生物学操作来鉴定基因，更无法进行生化操作去纯化酶，因此研究起来极其困难。但这个难题从来没有缺少过关注，很多实验室试图用其它方法来解决这个问题，也包括我们实验室。不少实验室宣称他们找到了DNA去甲基化酶，或者发现了参与DNA去甲基化的重要蛋白。但是这些结果要么没法重复，要么提出的模型不能被广泛的接受5-6。

直到2009年，美国科学院院士Anjana Rao及其同事的突破性发现为DNA去甲基化的研究打开了一个全新的窗口。他们发现哺乳动物中存在一种DNA双加氧酶——TET蛋白(Ten-Eleven-Translocation)，其在体外可以将5-甲基胞嘧啶氧化成5-羟甲基胞嘧啶（5-hydromethylcytosine, 5hmC）7，且5hmC稳定存在于胚胎干细胞及浦肯野细胞中8，这提示5mC可能通过氧化途径经由5hmC最终转化成不甲基化的胞嘧啶。说句题外话，Anjana Rao一直专注于免疫应答中NFAT（nuclear factor of activated T cells）信号通路的研究，她也是因为在这方面卓越的成就而被评选为美国科学院院士，她是怎么想起来研究DNA去甲基化，又是怎么发现TET蛋白的呢。今年4月份，我去Rao实验室进行博士后面试的时候，就这个问题问了她实验室的博士后。原来Rao在参加一次学术会议时听到在锥虫中存在一类DNA双加氧酶——JBP蛋白，其通过氧化作用将胸腺嘧啶羟基化，起始了base J生物合成反应。报告人预测在哺乳动物细胞中存在类似的DNA双加氧酶，还预测这类DNA双加氧酶可能参与DNA去甲基化。在这个想法的启发下，Rao及其同事用JBP蛋白的催化结构域进行blast，幸运地发现了保守性很高的TET家族蛋白。看来，做研究一定要做个有心人。

言归正传，5mC被TET蛋白氧化成5hmC之后，5hmC又是如何转变成不甲基化的胞嘧啶呢？这成为表观遗传领域一个新的热点问题。很多实验室致力于这个问题的解决，包括Rao实验室，北卡莱罗纳大学的张毅实验室和我们实验室。张毅是表观遗传领域知名的生物学家，霍华德休斯研究员，其在分离鉴定组蛋白修饰酶及研究组蛋白修饰的生物学功能等方面硕果累累。他在一篇回顾DNA去甲基化研究历史及展望DNA去甲基化研究前景的综述中提出5hmC转变成不甲基化胞嘧啶的几种可能途径6。其中一种途径是通过连续的氧化作用将5hmC转变成5-羧基胞嘧啶（5-carboxylcytosine, 5caC），随后5caC在脱羧酶的催化下去掉羧基而转变成胞嘧啶。这个假说的灵感来自于粗糙脉胞菌（Neurospora crassa）中的尿嘧啶代谢补偿途径9。首先，胸腺嘧啶在胸腺嘧啶水解酶（Thymine-7-hydrolyase，T7H）的催化下经三步氧化反应被转变成5-羧基尿嘧啶，随后5-羧基尿嘧啶在异乳清酸脱羧酶（iso-orotate decarboxylase，IDCase）的作用下转变成尿嘧啶。那TET蛋白是否具有类似于T7H的功能，通过连续的氧化反应将5mC转变成5-羧基胞嘧啶（5-carboxylcytosine, 5caC）呢？

我们实验室正是在这个假说的推动下开始了TET蛋白介导的DNA氧化去甲基化机制的研究。我们的做法很简单，从哺乳动物细胞中纯化全长的TET蛋白，然后将TET蛋白与5mC底物或者5hmC底物孵育，最后用薄层层析及高效液相色谱检测5mC或者5hmC的转变。值得一提的是，我们优化了Tet蛋白的体外反应条件，除了加入辅因子2-OG（2-oxoglutarate）及二价铁离子，还加入了1 mM ATP。正是ATP的加入，让我们检测到了更显著的5mC及5hmC的转变，但背后的机理到现在尚不清楚。高效液相色谱及薄层层析的结果显示5mC及5hmC被转变成一种新的形式。经质谱鉴定，这种新的修饰形式为5caC。在用薄层层析分析时我们对DNA底物有一个巧妙的设计。我们采用了限制性内切酶EcoNI，其识别序列为CCTNN-NNNAGG （N为任意核苷酸，在-处切开）。我们把5mC或者5hmC放在第三个N处，这样无论5mC及5hmC如何转变都不会影响EcoNI的酶切，从而可以准确地捕捉到5mC及5hmC的变化。与体外结果一致的是，在过表达TET蛋白的293T细胞中可以在基因组DNA中检测到内源性的5caC。这些结果表明TET蛋白确实可以通过氧化作用将5mC转变成5caC。那么Rao实验室当时怎么没有发现5caC呢？其原因可能在于他们所用的限制性内切酶是TaqI（其识别序列为T-CGA，在-处切开）。后来的实验室证明5caC会抑制TaqI的酶活。

接下去的问题是5caC如何转变成不甲基化的胞嘧啶的呢？是存在类似于IDCase的5caC脱羧酶，还是其它的途径呢？让我们把目光转向2010年，英国剑桥大学的Azim Surani及其同事发表在Science上的研究工作显示碱基切除修复途径参与了小鼠生殖系的重编程，他们推测存在一种糖苷酶参与了DNA去甲基化，但他们并没有鉴定到这样的糖苷酶10。他们当时认为这样的糖苷酶可以直接识别5mC或者5hmC，并没有考虑到5caC。我们想会不会存在特异识别5caC的糖苷酶。首先，我们在胚胎干细胞的核抽提物中检测到了较弱的切除5caC的糖苷酶活性。随后，我们纯化了目前已知的四种针对G/U错配的糖苷酶，即TDG （Thymine DNA glycosylase），MBD4 (Methyl-binding domain 4)，UNG1(Uracil DNA glycosylase)及SMUG1 (Single-strand selective monofunctional uracil DNA glycosylase)，并检测了这些糖苷酶是否可以特异性地切除5caC，结果显示这四种糖苷酶中只有TDG可以特异性地切除5caC。进一步用anti-TDG抗体免疫去除ES核抽提物中内源的TDG蛋白导致核抽提物中5caC切除活性的大大降低。Tdg knockdown的ES细胞或者Tdg knockout的iPS细胞的核抽提物中5caC切除活性基本消失，同时在这两种细胞中均可以用HPLC-MS-QQQ的方法检测到5caC的积累。这些结果有力地证明5mC可在双加氧酶TET的催化下转变成5caC，而5caC则进一步通过TDG介导的BER途径转变成未甲基化的胞嘧啶11。与此同时，张毅实验室也发现了同样的生化机制。他们发现TET蛋白可以在体外将5hmC顺序氧化成5-醛基胞嘧啶(5-formylcytosine, 5fC)和5caC，并用质谱方法在ES细胞及多种小鼠组织中检测到5fC和5caC的存在12。我们两个实验室的文章肩并肩发表在2011年的Science第333期上，巧合的是，我的同学兼好友沈立是张毅实验室工作的主要完成人之一。但张毅实验室没有继续深入研究5caC如何转变成未修饰的胞嘧啶。所以，我们实验室首次相对完整地提出了哺乳动物DNA主动去甲基化的一种全新分子机制

参考文献
1    Jaenisch, R. & Bird, A. Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals. Nat Genet 33 Suppl, 245-254 (2003).
2    Goll, M. G. & Bestor, T. H. Eukaryotic cytosine methyltransferases. Annual review of biochemistry 74, 481-514 (2005).
3    Reik, W., Dean, W. & Walter, J. Epigenetic reprogramming in mammalian development. Science 293, 1089-1093 (2001).
4    Reik, W. Stability and flexibility of epigenetic gene regulation in mammalian development. Nature 447, 425-432 (2007).
5    Zhu, J. K. Active DNA demethylation mediated by DNA glycosylases. Annu Rev Genet 43, 143-166 (2009).
6    Wu, S. C. & Zhang, Y. Active DNA demethylation: many roads lead to Rome. Nat Rev Mol Cell Biol 11, 607-620 (2010).
7    Tahiliani, M. et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science 324, 930-935 (2009).
8    Kriaucionis, S. & Heintz, N. The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain. Science 324, 929-930 (2009).
9    Smiley, J. A., Kundracik, M., Landfried, D. A., Barnes, V. R., Sr. & Axhemi, A. A. Genes of the thymidine salvage pathway: thymine-7-hydroxylase from a Rhodotorula glutinis cDNA library and iso-orotate decarboxylase from Neurospora crassa. Biochim Biophys Acta 1723, 256-264 (2005).
10    Hajkova, P. et al. Genome-wide reprogramming in the mouse germ line entails the base excision repair pathway. Science 329, 78-82 (2010).
11    He, Y. F. et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science 333, 1303-1307 (2011).
12    Ito, S. et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science 333, 1300-1303 (2011).