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标题:【求助】转膜后丽春红染色无条带

mogu[使用道具]
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发表于 2013-12-13 22:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】转膜后丽春红染色无条带

各位战友，本人最近开始做western，但似乎很不成功。主要表现为：ECL发光、压片后几乎全是光板，偶尔有极其微弱的条带，前面实验证明一抗和二抗都没有问题。怀疑问题出在转膜上，主要表现为：转膜后丽春红染色观察不到条带。对于样品，经过BRADFORD法鉴定，蛋白浓度还很高的。经过电泳后，胶条经考马斯亮蓝染色也有明显的条带。转膜采用的是bio-rad湿转系统，转膜液配方：glycine 2.93g，Tris 5.8g，SDS 0.37g，恒压100V转移100分钟，目的蛋白分子量17KD，内参为GAPDH。marker采用fermentas的marker系统，marker在转膜后在膜上清晰显现，但是丽春红染色没条带。转膜后胶条经考马斯亮蓝染色也没有条带。
请各位大侠指导！小弟感激不尽！
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ffaa[使用道具]
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发表于 2013-12-13 22:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
分子量太小，没有必要转100分钟，可以考虑缩短转膜时间！
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了了[使用道具]
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发表于 2013-12-13 22:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

转膜时间有点久吧 蛋白估计都跑到外面去了
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mogu[使用道具]
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发表于 2013-12-13 22:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

但是内参gapdh也做不出来啊，难道都转过了？
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小野花[使用道具]
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发表于 2013-12-13 22:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我看到你的电转液中怎么没见甲醇啊？你试试这个电转液配方：电转缓冲液1000ml

1称量Tris3.03的去离子水，充分搅拌溶解
2.加入600ml去离子水，充分搅拌溶解
3.加入200ml 甲醇
4补足液体(去离子水)至1000ml，室泪保存
我一直用的这个配方，挺好的。还有你转膜的时间确实长了点。适当的缩短点。
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发表于 2013-12-13 22:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谈谈我的看法
1.首先是你的目的蛋白是17kD的小蛋白，转膜时间过长，很有可能目的蛋白转到膜外去了。
所以，你可以尝试下用2张膜一起转，把第2张膜拿去用考马司亮蓝看下是否有蛋白，如果有的话，说明你的转膜时间长，可以减少转膜时间。如果，第2张膜上没有的话，恭喜你，你可以直接使用这个条件转膜了。（我用的是PVDF膜）

2.另外，不知道你用的是不是PVDF膜转膜的，如果是的话，在你用甲醇激活膜之后，要用含有甲醇的buffer去转膜。
我的transfer buffer的配方是：
Tris 1.51g
Glycine 7.2g
MeOH 100ml
然后用MiliQ water 定容到500ml

以上是我的建议，供你参考。
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发表于 2013-12-13 22:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我一个同事转的16KD，条件：湿转，恒流，200mA，90min。曝光结果很好。首先你的转膜缓冲液最好在用前加20%的甲醇，因为甲醇是会挥发的。另外转膜前应该用架甲醇把膜泡上一会，大概十五秒钟即可。转膜时应该保持低温，在周围放上冰块。转膜后观察Marker有没有转上去。
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发表于 2013-12-13 22:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

估计你的蛋白都转过了，不知道你用的是PVDF膜还是NC膜，一般来说PVDF膜转移效果要好，另外你的缓冲液中没有甲醇，而且一般甲醇浓度高的缓冲液对低分子量蛋白的转移效果好，而甲醇浓度低甚至不含甲醇的缓冲液则有利于高分子量蛋白的转移，你的目的蛋白分子量很低，建议用20%甲醇的转移缓冲液，我常用的缓冲液配方是：
Tris 3.03g
glycin 14.41g
甲醇 200ml
加蒸馏水至1000ml
转移条件：30V恒压1-2小时，一般1.5小时左右
以上条件在我们实验室试过多次，没有问题
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vcve[使用道具]
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发表于 2013-12-13 22:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也遇到过的 我的问题是在转膜缓冲液上 换了缓冲液就好了
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mogu[使用道具]
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发表于 2013-12-13 22:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

现在问题好了！现在转膜是这样子的，可以看到膜整个是一片红，但是看不到单独的条带，请问这样子是正常的吗？因为我western总是做不出来，所以考虑是不是样品本身有问题。


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2013-12-13 22:16
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