【求助】蛋白表达出来总是包涵体

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标题:【求助】蛋白表达出来总是包涵体

yes4[使用道具]
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发表于 2013-12-14 14:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我有一个蛋白，克隆，测序正确后连入pET21b和pET24a后表达，但总是包涵体。我的基因大小为1.3 k，表达时使用16度低温诱导，IPTG浓度0.4 mM。带C端his标签。请问各位大侠现在该怎么办啊？这两个表达载体没有问题，表达其他蛋白时正常。诱导的方式也是我表达所有蛋白时通用的。

jkobn[使用道具]
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发表于 2013-12-14 14:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

pET32、PGX融合表达，或酵母、CHO真核表达。

avi317[使用道具]
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发表于 2013-12-14 14:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有的时候跟载体的关系不大，毕竟影响因素太多了，有的基因再怎么在原核表达都是包涵体。可以尝试更换弱启动子的载体，让表达水平不要那么高；或者尝试含有伴侣分子的载体可以辅助折叠；还可以尝试GST等融合表达，GST可溶性比较好而且有一定的辅助折叠作用；版主推荐的真和表达如果只是研究（需要的量不大）而不是开发的话也可以尝试；实在不行的话就纯化包涵体吧，也不见得就比可溶性表达的难！

plaa[使用道具]
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发表于 2013-12-14 14:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

与目的蛋白氨基酸序列本身有关或者说疏水性有关。如果想得到可溶表达产物，可以尝试表达Trx融合蛋白或其他溶解性较好的融合蛋白。包含体表达易于纯化，可以花点精力在纯化后的蛋白复性上。

one[使用道具]
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发表于 2013-12-14 14:58 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1. 蛋白本身性质已形成包涵体

2. 原核融合可以尝试，但不保证，多少蛋白融合了高水溶伴侣依旧包涵体表达

3. 共表达是个不错的注意，可以尝试，搞个小文章也不错

4. 酵母可以试试，CHO更可以试试，但操作比大肠要麻烦那么一点

5. 如果专业表达纯化，好好摸摸，管它可溶不可溶，都试试，说不准搞出点门道；如果只是那蛋白用，别再构建了，包涵体复性，也是很好的选择

祝好！
X

ero11[使用道具]
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发表于 2013-12-14 15:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用的GST表达，16度，0.1IPTG，上清一点没有表达，都是包涵体。正在复性中！

star#room[使用道具]
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发表于 2013-12-14 15:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1.一般用原核表达糖蛋白之类的都会是包涵体，不过现在复性研究也比较多，稀释，柱上复性都是好的选择。
2.我个人感觉用CHO细胞表达虽然省了复性步骤，但是也会遇到2个大问题，一个问题是成本高，而且我个人感觉刚开始表达的时候都会遇到表达量低的问题，我遇到的CHO细胞表达的蛋白未驯化和工艺优化前基本上就几个mg/L，耗费时间不比包涵体复性少。你那里如果实验条件可以的话，多构建几个克隆，流式细胞仪筛选，如果你导师有钱，直接购买高表达的动物细胞。用CHO细胞还有一个问题就是后期纯化，CHO细胞除了你所需的目的蛋白，还会分泌一些自身蛋白，到时候即使用Ni柱亲和纯化出来SDS反映也是密密麻麻的一片，用his标签除了考虑蛋白折叠屏蔽纯化标签外，还有粗纯速度慢问题，比较麻烦

wmp1234[使用道具]
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发表于 2013-12-14 15:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你是只用一个温度摇菌吗？你应该做个小量表达测试，先做几个不同的温度测试一下效果嘛，一般都是37C ，26C ，18C这三个温度。如果这三个温度都是包涵体的话，那么你就选换载体或做复性罗，其实包涵体复性也不错啊，我做的基因大多数都是包涵体，得到的结果也让领导满意。

00无名指00[使用道具]
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发表于 2013-12-14 15:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

换载体，或用包涵体复性。