表观遗传学

表观遗传学（epigenetics）以不涉及DNA序列变化的、可遗传的基因表达调控信息传递为主要研究内  容。 “组蛋白密码”是其重要部分 [1]。核心组蛋白上的共价修饰，在真核细胞的染色质结构重塑和基因表达调控方面起重要作用 [2]。组蛋白甲基化作为一个关键调节因素，被认为在基因表达的抑制或者活化，以及染色体结构域中发挥了关键作用。
研究表明在细胞核内，组蛋白甲基化和去甲基化过程处于动态平衡，两过程分别由组蛋白甲基转移酶和组蛋白去甲基化酶催化[3]。由此得知，组蛋白甲基化的位点和状态与两种酶的含量及活性密不可分。
近年来，组蛋白甲基化方面的检测技术取得了迅猛发展，一些独特的新实验技术已开始运用。本文对目前用于组蛋白甲基化及其相关酶类检测技术与方法作一篇综述。
   
                         组蛋白甲基化及其相关酶
            
1．组蛋白甲基化是指发生在H3和H4组蛋白N端精氨酸或者赖氨酸残基上的甲基化。目前发现24个组蛋白甲基化位点。甲基化可以是单=位点、双位点或三位点 [4]，共有3×1011种组蛋白甲基化组合状态。生物体则以组蛋白密码的方式发挥着各种生物功能。真核模型系统中，组蛋白H3K4、H3K36、H3K79甲基化与可遗传转录活力相关。在K9、K27发生的赖氨酸甲基化同基因抑制相关。甲基化的H3K9被发现与异染色质蛋白质-1结合在着丝粒周围，也见于其他遗传性染色体抑制区域，与着丝粒周围染色质凝集和X染色体失活有关[2]。综上所述，组蛋白甲基化的功能主要体现在异染色质形成、基因印记、X染色质失活和转录调控方面。

2．组蛋白甲基转移酶（histone methyltransferase,HMT）催化组蛋白甲基化。包括精氨酸甲基化转移酶（protein arginine methyltransferase,PRMT）和赖氨酸甲基化转移酶（histone lysine methytransferase,HKMT）。PRMT家族包括PRMT1、PRMT2、PRMT3、PMT1/HMT1、PRMT4/CARM1、PRMT5。PRMT家族中包含一个保守的催化核心区。由PRMT1和CARM1催化形成的不对称二甲基化组蛋白和基因活化有关，而由PRMT5催化形成的对称二甲基化组蛋白则与基因抑制有关。催化赖氨酸甲基化的酶被通称为含SET（Su(var),Enhancer of zeste,Trithorax）结构域的家族，进化上高度保守[5],两侧有前SET域和后SET域。HKMT有上百种，分为四大家族：SUV39、SET1、SET2、RIZ。SUV39家族具有前-SET域，该结构域使SET域特意作用于H3K9、H4K20发挥活性，被认为是组成性异染色质的主要决定因素。EZH2复合物属于SET1家族，催化H3K27甲基化，依赖PcG蛋白进行基因遏制[6]。SET2介导H3K36甲基化，发挥基因转录抑制功能。目前，对RIZ家族介导的甲基化研究甚少。
3．组蛋白去甲基转移酶（histone demethylation,HDM）LSD1/BHC110可以特异性将单、双甲基化的H3K4去甲基化，不能去三甲基化的赖氨酸[7]。后又发现一类含JmjC域的去甲基化酶，目前分为JHDM1、JHDM2和JHDM3三个家族。JHDM1针对H3K36me1去甲基化。JHDM2家族包括JMJD1A/JHDM2A, JMJD1B/JHDM2B， JMJD1C/JHDM2C/TRIP8三种蛋白。据推测人无毛蛋白HR属于JMJD1A/JHDM2A 家族,HR具有甲状腺受体转录辅阻遏物的功能[8]。JHDM3家族中JMJD2A/JHDM3A针对H3K9me3/2和H3K36me3/2去甲基化，是重要的赖氨酸三甲基化特异性的去甲基化酶，发挥转录抑制活性。JMJD2B针对H3K9me3，JMJD2C/GASC1针对H3K9me3和H3K36me3,而JMJD2D针对H3K9me3/2，进行去甲基化[9]。

组蛋白甲基化检测

伴随表观遗传学的发展，一些独特的新技术随之产生。其中用于组蛋白修饰检测的技术以染色质免疫沉淀技术为核心，结合各种PCR技术和生物芯片技术，便可满足不同层次组蛋白修饰研究的需要。传统的Western免疫印迹技术在组蛋白修饰检测方面也有一定价值。此外，还可运用质谱分析技术来进行此类研究。
1．染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation，CHIP）被广泛用于鉴定修饰后组蛋白及其他染色质相关因子在基因组的定位，是体内研究DNA-蛋白质相互作用的强有力工具。此方法与生物芯片和分子克隆技术相结合,用于高通量的筛选已知蛋白因子的未知DNA靶点和研究反式作用因子以及特定的组蛋白修饰在整个基因组上的分布情况 [10]。CHIP 与PCR技术、Southern blot、狭缝杂交技术结合，为研究组蛋白修饰在基因表达中的作用，全面阐明真核基因的表达调控机制提供了强有力的研究工具。
CHIP技术一般有两种方法，区别在于不同的染色质处理手段。一种方法是使用标准微球菌核酸酶来消化细胞核，称为非变性染色质免疫沉淀（nChIP）,用来研究同DNA有高亲和力的蛋白，如组蛋白及其修饰后同工体等[11]；另一方法是在细胞中加入甲醛或者将细胞暴露在紫外线下使染色质交联，接着用超声波将染色质切割成小片段，这个方法被称为xChIP。如果研究者对研究同DNA结合亲和力不高的蛋白质有兴趣，如绝大多数非组蛋白的蛋白质，那么这个方法是唯一的选择。
    组蛋白甲基化检测的研究，nChIP是适宜的选择。优点在于：1.可达到单核小体水平上的高分辨率。2.免疫沉淀所得的蛋白质复合物可直接用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，有助于把握免疫沉淀的效率。3.在nChIP准备阶段丢失的蛋白质可能会对附着有转录因子的修饰后核小体有帮助，而在xChIP中这些蛋白质一并被沉淀下来【2】。
原理：
细胞核用微球菌酶消化后释放出来的染色质可以通过蔗糖梯度离心来分离出单个核小体和双联核小体。然后利用特异性抗体将含有蛋白质或者修饰后蛋白质的染色质片段进行免疫选择。这样，就可以对特定位点基因或者位点上的蛋白质或者甲基化等修饰进行精确的基因定位。免疫沉淀染色质中抽提出的DNA序列内含物可以通过DNA印迹、或者PCR反应分析。
nChIP可分为四个步骤【2】：
Ⅰ. 染色质的准备：
提取细胞核，缓冲液重悬。微球菌核酸酶在20℃消化细胞核。注意：时间和酶剂量需按照细胞类型的不同而调整。
Ⅱ. 通过蔗糖梯度离心分离确切长度的染色质片段。
Ⅲ.特异性抗体进行非变性染色质免疫沉淀（nChIP）
Ⅵ.染色质免疫沉淀的DNA的分析和甲基化组蛋白在DNA上结合位点的鉴定
染色质免疫沉淀的DNA分析方法有多种。如果所研究的甲基化组蛋白的靶序列是已知的或者怀疑某个序列，则此甲基化组蛋白的靶序列DNA可以采用Southern blot和PCR分析。
Southern blot方法准确度较高、但操作复杂。PCR方法中，琼脂糖定量法简单方便，但准确性低；同位素PCR法准确性虽有提高，但操作不便；real-time PCR法虽可做到实时定量，准确性高，但价格昂贵。
如果甲基化组蛋白的靶序列未知或者预研究此甲基化组蛋白在基因组上的分布情况,找出反式作用因子的结合位点,采用CHIP与蛋白质芯片结合所形成的CHIP-on-CHIP技术。
2．Western免疫印迹（Western Blot）广泛用于蛋白质表达水平的检测，但只能从细胞以及组织的整体水平上进行甲基化组蛋白的检测，远远不能满足更深一层次研究需求。
3．生物芯片[12]鉴于其高通量、微型化和自动化的优点，逐渐被研究者广泛采用。
常用生物芯片有三大类：基因芯片(gene chip)、蛋白质芯片(protein chip)和芯片实验室(1ab on a chip)。
蛋白质芯片的出现为我们提供了一种比传统的凝胶电泳、Western blot及酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)更为方便、快速的研究蛋白质的方法。它能够提供一份涵盖整个基因组序列位点的组蛋白甲基化表达图谱。帮助研究者选择出有研究意义的组蛋白甲基化位点，再针对性进行具体研究。CHIP-on-CHIP技术是这方研究的具体运用。

组蛋白甲基化酶（HMT）和去甲基化酶(HDM)的检测

1．为明确组蛋白甲基化维持动态平衡的机制以及特定时间的存在状态，需要对HMT、HDM的蛋白水平进行研究。
蛋白质的研究通常选用Western免疫印迹和酶联免疫吸附剂测定(ELISA)。二者相比Western Blot价位低廉，适用于活组织和细胞内蛋白的定量研究，但敏感性低。ELISA价格昂贵，但可用于久己存放的组织切片中特定蛋白定性及定量研究，且所需样本含量小，为临床病例的病理研究提供了极大的方便。对于HMT、HDM检测多在活体进行，有相对充足的样本，选用Western Blot适宜。
          2 ．实时RT-PCR对HMT、HDM mRNA的相对定量分析[13]：
与传统测定方法相比，实时RT-PCR克服了Northern blot、核糖核酸酶保护试验需要较多的RNA量的重要缺点，且具有敏感性和特异性。RT-PCR依赖于琼脂糖凝胶电泳来观测分析产物，不同的样品间所感兴趣的转录水平出现在对数线性区的显著性差异需要不同的PCR循环数，导致不同样品所适合对数线性处于截然不同的循环数目上，从而使得测定的可能性不大。实时RT-PCR是通过共价和非共价荧光标记物或者探针渗入到PCR产物在每次PCR循环完成时对其进行分析，结合软件实时分析荧光数据，从而对mRNA转录产物进行更为精确的绝对或者相对定量分析。
    3.组蛋白甲基化酶（HMTase）和去甲基化酶(HDMase)活性的检测[14-15]
    细胞中组蛋白甲基化酶及去甲基化酶对细胞状态的影响取决于两个方面:一方面,酶的量;另一方面,酶的活性。上述诸多方法检测细胞中酶的含量。而检测酶活性的常规方法是免疫共沉淀技术，基本原理为：首先创造一个适宜的酶作用液态环境（温度、PH值、离子环境等），再通过免疫共沉淀技术将目的酶特异性沉淀、分离。然后加目的酶及其作用底物和原料一并入准备好的液态环境中，给予一定的反应时间，生成目的产物。用SDS-PAGE凝胶电泳分离目的产物，照相并记录结果。目的产物的量与酶的活性成线性关系。使用软件对照相结果进行分析,得出有关酶活性的结论。
目前用于检测此类酶活性的实验少有报道，期望更优的实验方法产生。

展望
      组蛋白甲基化作为表观基因调控过程中重要的组成部分，其异常与肿瘤及其他相关疾病的发生关系密切，因而组蛋白甲基化的检测技术方法就显得极其重要。充分利用上述这些技术，可以帮助我们初步了解组蛋白甲基化在生命体中的存在状态。但根据目前的技术水平，尚有诸多问题无法阐释清楚。期待新技术的发明，以助人类医学迈上新的阶梯。

参    考    文    献
1 Strahl BD，Allis CD.ect.The language of  covalent histonemodification. Nature,2000,403(6765):41-45.
2 Trygve O，Tollefsbol著，吴超群译。表观遗传学实验手册。上海：上海科学技术出版社 2007.8：27-57.348-361
3 Yujiang Shi,Fei Lan,Caitlin Matson,et al.Histone Demethylation Mediated by the Nuclear Amine Oxidase Homolog LSD1 Cell,2004,119:941-953.
4 A.J.Bannister,R.Schneider,T.Kouzarides,ect.Histone methylationynamic or static? Cell,2002.10901-806.
5 Taylor,W.R.,B.Xiao,S.J.Gamblin,et al.A knot or not a knot? SETting the record straight on protein.Comput Biol Chem,2003,27:11-15
6 R.Cao,Y.Zhang,et al.The functions of E(Z)/EZH2-mediated methylation of lysine 27 in histone H3.Curr Opin Genet Dev.2004,14:155-164.
7 Yujiang Shi,Fei Lan,Caitlin Matson,et al.Histone Demethylation Mediated by Nuclear Amine Oxidase Homolog LSD1 Cell.2004.118:545-553.
8 K.Yamane,C.Toumazou,Y.Tsukada,et al.JHDM2A,a Jmjc-containing H3K9 demethylase,facilitates transcription activation by the androgen receptor.Cell,2006,125:483-495.
9 J.R. Whetstine,A.Nottke,F.Lan,et al. Reversal of histone lysine trimethylation by the JMJD2 family of histone demethylases.Cell,2006.125:467-481.
10 Weinmann A S,Farnham P J. Idnetification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation. Methods,2002,26:37-47.
11 Laura P,Neill O,Turner B M.Immunoprecipitation of native chromatin:nChIP.Methods,2003,31:76-82.
12 张萍，杜贤宇。 蛋白质芯片技术的分类、研究与应用进展 【J】Chin J Dis Control Prev 2004 June 8(3).250-253
13 C.W.迪芬巴赫，G.S.德弗克斯勒编，种康，瞿礼嘉译。PCR技术实验指南。北京：化学工业出版社。2006.3：159-166
14 Stephen Rea, Frank Eisenhaber. et al. 2000. Regulation of chromatin structure by site-specific  histone  H3
Methyltransferases. Nature 406:593-5 99.
15 Roberta Carbone, Oronza A.et al. Recruitment of the Histone Methyltransferase SUV39H1 and Its Role in the Oncogenic Properties of the  Leukemia-Associated PML-Retinoic Acid Receptor Fusion Protein. Molecular and Cellular Biology.Feb.2006.1288-1296.