蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】包涵体复性之后,蛋白本身的性状是否改变?

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

标题:【求助】包涵体复性之后,蛋白本身的性状是否改变?

hold住[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75093
精华 0
积分 566
帖子 832
信誉分 100
可用分 4962
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
1
 

【求助】包涵体复性之后,蛋白本身的性状是否改变?

包涵体复性之后,蛋白本身的性状是否改变?若是改变,这是否影响蛋白自身具有的性质?在免疫小鼠,测蛋白晶体结构方面,这种复性,对其是否有影响?
顶部
INK[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 73382
精华 0
积分 348
帖子 375
信誉分 100
可用分 2696
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-22
状态 离线
2
 
蛋白在变性之后,整个蛋白的高级结构被破坏,但是一级结构不改变。再复性之后,原来的高级结构大部分恢复,一些二硫键,疏水作用力,氢键等重新建立。当然,这不是100%可逆的。免疫小鼠是完全可以的,就是国际上的大生物公司制备抗体的时候,也是原核表达蛋白。
至于测晶体结构,不是很懂。
顶部
hold住[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75093
精华 0
积分 566
帖子 832
信誉分 100
可用分 4962
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
3
 


QUOTE:
原帖由 INK 于 2013-12-14 15:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
蛋白在变性之后,整个蛋白的高级结构被破坏,但是一级结构不改变。再复性之后,原来的高级结构大部分恢复,一些二硫键,疏水作用力,氢键等重新建立。当然,这不是100%可逆的。免疫小鼠是完全可以的,就是国际上的大生物公司制备抗体 ...

谢谢赐教,想知道,从“变性——复性”,这个过程,已经被公认没有任何蛋白最原始的性质的改变了吗,如果不是100%的恢复性状,蛋白的功能不受这样一过程的影响吗?
谢谢!
顶部
49888[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77494
精华 0
积分 776
帖子 1211
信誉分 100
可用分 6906
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态 离线
4
 

蛋白的功能一般可以恢复。因为蛋白的功能的实现,通常是一个或几个活性中心。
顶部
PINK[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 73133
精华 0
积分 418
帖子 536
信誉分 100
可用分 3488
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-19
状态 离线
5
 


QUOTE:
原帖由 hold住 于 2013-12-14 15:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
包涵体复性之后,蛋白本身的性状是否改变?若是改变,这是否影响蛋白自身具有的性质?在免疫小鼠,测蛋白晶体结构方面,这种复性,对其是否有影响? ...

如果你相信蛋白质的天然构象是这条多肽链的最低能量状态,那么就应该相信蛋白本身的性状不会改变,比如催化活性,分子表面电荷分布,分子尺寸,聚合态。

看到丁香园上很多人写免疫小鼠的话,变性状态的蛋白质也可以。没做过,也没听丁香园之外的人说过,不太清楚。

如果是想做复性-结晶,也有实验室做,但是非常非常少。不是因为怀疑结构上有什么变化,而是因为复性本身的难度。他们如果遇到怎么也不能可容表达的蛋白质,一般就是放弃,而不会做复性。
顶部
one[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73393
精华 0
积分 697
帖子 1114
信誉分 100
可用分 6353
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-22
状态 离线
6
 

做结晶的一个准则就是你的蛋白要uniform,homogeneous
如果复性不完全(很少有完全的),没事,不过要能把未复性和复性的蛋白分开,得到完全的复性蛋白,否则结晶过程中就会有麻烦(就像起房子加入了烂砖头,房子不能砌成或者能砌但不牢固一样的道理)。

蛋白是否复性,要有能够检测的办法来确定。在inclusion body被溶解后都是random的结构,所以CD可以作为初步判断(是否复性),但最好有活性检测(如果是酶的话).

具体问题再发上来具体分析。
顶部
hold住[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75093
精华 0
积分 566
帖子 832
信誉分 100
可用分 4962
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
7
 


QUOTE:
原帖由 one 于 2013-12-14 15:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

做结晶的一个准则就是你的蛋白要uniform,homogeneous
如果复性不完全(很少有完全的),没事,不过要能把未复性和复性的蛋白分开,得到完全的复性蛋白,否则结晶过程中就会有麻烦(就像起房子加入了烂砖头,房子不能砌成或者能砌但不 ...


谢谢赐教,我看到,有人利用反相质谱仪,来确定复性得到的蛋白的homogeneous,通过波的单一性,及特定时间的出现等来判断,不知道其具体怎么理解?望高手指点
顶部
tuuu2[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77597
精华 0
积分 507
帖子 674
信誉分 100
可用分 4211
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-18
状态 离线
8
 

一般蛋白质都含有二硫键,如果该蛋白含有二硫键,最常用的检测复性是否成功的方法就是非还原情况下进行SDS-PAGE分析,如果有天然结构蛋白标准品,如复性成功则条带会很均一,大小与标准品一致;如果没有标准品,则复性成功的蛋白与变性时蛋白相比SDS-PAGE表观分子量偏小,复性后如含多个条带时一般下带为复性成功条带,可以此为眼进行分离纯化。
用反相HPLC检测复性成功与否是利用蛋白的疏水性质进行判定,由于蛋白折叠和二硫键的差异,变性蛋白与复性蛋白疏水性质会有差别,致使两者保留时间会有差异,可以此来判断复性成功与否,国际通用的胰岛素结构检测就是利用RP-HPLC进行检测的,同时根据RP-HPLC的峰面积还可以判定胰岛素活性高低。
如果想进行系统的检测,可以进行CD分析(比较二级结构)和荧光发射光谱分析(比较三级结构),再加上活性检测,如果复性后上述三个结果与活性标准品一致,则可初步认为复性成功;复性是否成功没有严格的界限,就像包涵体形式蛋白和可溶表达形式蛋白之间没有严格划分标准一样,复性成功后蛋白只能说结构接近于天然活性蛋白,但是仍然会与天然活性蛋白有细微的差别,这也是为什么人们在蛋白结晶分析时一般不用复性后蛋白进行分析的原因。
免疫小鼠是进行抗体制备,这时只要抗原的一级结构正确就可以,无所谓是否复性成功,所以大多数情况下都是用变性蛋白进行动物免疫,因为这个省事省时。
顶部
hold住[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75093
精华 0
积分 566
帖子 832
信誉分 100
可用分 4962
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
9
 


QUOTE:
原帖由 tuuu2 于 2013-12-14 15:21 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

一般蛋白质都含有二硫键,如果该蛋白含有二硫键,最常用的检测复性是否成功的方法就是非还原情况下进行SDS-PAGE分析,如果有天然结构蛋白标准品,如复性成功则条带会很均一,大小与标准品一致;如果没有标准品,则复性成功的蛋白 ...

你所说的,无所谓包涵体复性程度,只要一级结构不变,就可以免疫动物,制备其特异性抗体。请问有这方面相关文章作为证据嘛。我就是想有个例子,这样为以后的文章作为证据之一,因为现在不是很确定。
最后谢谢你的帮助!
顶部