【求助】有提取膜蛋白的高手请进来指教

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标题:【求助】有提取膜蛋白的高手请进来指教

quiqui008[使用道具]
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发表于 2013-12-14 21:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

小弟现在做脑内一种双孔钾通道（TREK1分子量60kd）的蛋白检测。按照常规的western方法做了好几次，均未见目的条带。但β-actin每次都很清晰。而国外的文献中有人已经多种证明了它的存在。小弟具体方法如下：
上样量60μg蛋白
电泳（恒压）5%的集成胶60mv，40分钟，10%的分离胶100mV，1小时，
电转（恒流），300mA,1小时
封闭，5%脱脂奶粉，常温2小时（稀释牛奶用的TBST，
一抗（Alomone，1：200，5%脱脂奶粉稀释）4℃过夜）
TBST 10min*3次

二抗（1：1000）室温2小时
TBST 10min*4次
ECL液显影
请各位高手看看，问题出在什么地方，谢谢了！

ffaa[使用道具]
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发表于 2013-12-14 21:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我最近在也在做细胞表面钾离子通道蛋白，分子量大约为50KD，按理说很好做才对。但是自从第一次做的时候能够曝出微弱的条带以后就再也重复不出来了，我做的过程跟你的差不多，真的不知道到底哪出问题了，是不是必须要用膜蛋白提取试剂盒才能做出来啊？我用的的是ABCAM的抗体，内参每次都很好。REALTIME PCR 已经显示这种蛋白是存在的。

ffaa[使用道具]
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发表于 2013-12-14 22:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼主,你提供的背景不够。
1. 你这里报告的是western的条件。如果你想看你的western是不是有问题，做一个标准蛋白就可以了。protocol我相信没问题，但如果你对自己操作没信心的话一个标准蛋白就会告诉你你的检测灵敏度有多高。你说actin没问题，但那个丰度是挺高的，所以你首先要排除不是你的灵敏度出问题。

2. 国外文献证明存在。你是不是做的全组织？还是说过量表达？这些东西对回答你的问题有帮助。比如如果是过表达，可能你的条件不够优化等。

3. 你的膜蛋白提取成功吗？protocol是不是也是按照别人发的文章做的？可以看看膜蛋白有没有被提出来。如果有超高速离心机的话做个fraction分离可溶和膜蛋白部分再提取就可以看出来。分别电泳就可以看出来。或者可以用一些膜蛋白特异蛋白检测的方法。

4. 蛋白是不是被降解了？蛋白是不是要某些诱导条件下才能检测到？

等等

quiqui008[使用道具]
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发表于 2013-12-14 22:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我想问楼上，50KD左右的蛋白在转膜的时候是应该是很好转的，在WEST的操作上应该是不成问题的，我想问一下在内参没有问题的情况下是不是膜蛋白在所提取的总蛋白中的丰度不够，是不是所有的在细胞膜表达的蛋白都是必须用膜蛋白提取试剂盒？

ffaa[使用道具]
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发表于 2013-12-14 22:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

回复 #4 quiqui008 的帖子

首先我感觉灵敏度应该不会有问题。另请问如何鉴定其灵敏度？
我做的是全组织的。我提取膜蛋白是按照别人得文献的步骤提的，但我发现与平时常用的没有太大的区别。
超高速离心机做个fraction分离可溶和膜蛋白部分再提取，然后分别电泳小弟还没有做过。请问具体protocol能否请看楼上指教下。此外，一些膜蛋白特异蛋白检测的方法能否请楼上群友简要介绍下。
提取蛋白过程中我相当小心，整个过程应该不会有太大的问题。另外，我同时加用了coctail和PMSF。

quiqui008[使用道具]
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发表于 2013-12-14 22:05 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我想问你一下如果做离子通道蛋白的话就必须用膜蛋白提取试剂盒吗？用RIPA 提取的话就一定不行吗？如果要用膜蛋白提取试剂盒的话你建议用哪个公司的会好一点？谢谢！

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发表于 2013-12-14 22:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 ffaa 于 2013-12-14 22:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
首先我感觉灵敏度应该不会有问题。另请问如何鉴定其灵敏度？
我做的是全组织的。我提取膜蛋白是按照别人得文献的步骤提的，但我发现与平时常用的没有太大的区别。
超高速离心机做个fraction分离可溶和膜蛋白部分再提取，然 ...

楼主，
灵敏度的检测，你作一系列浓度梯度，比如从0.1 ng, 1 ng, 2 ng, 5 ng, 10 ng 等等，看你能看到哪条带。

如果作crude membrane提取的话，现破碎细胞，低速离心去沉淀，然后上清超高速离心（100，000g），沉淀就是膜部分。这样的话protease 要少很多，因为可溶性蛋白都在第儿步的上清中去掉了。

膜蛋白特异检测，我的意思是，首先你要知道你的蛋白分布在哪里（如果是真核细胞的话），然后在这个fraction中是否有一种蛋白是特异的（其他地方没有），然后检测方法又简单（比如碱性磷酸酶就好检测），通过这种特异活性检测，你可以得出结论：这个fraction上的蛋白被你提取出来了。然后如果没看到你的目的蛋白再找别的原因。

我主要作重组蛋白，而且作细菌，对于真核组织不太了解，所提建议非常受本人经历所限制！

祝好运。

quiqui008[使用道具]
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发表于 2013-12-14 22:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我查了文献中是这样描述的，首先去除碎片和细胞核，取上清接着100000G，60min后沉淀的部分是细胞膜，用裂解液溶解。上清是可容部分。我想问的是如何有效充分的“破碎细胞”？

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发表于 2013-12-14 22:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

破碎真核组织，方法有homogenizer （匀浆机）， sonication（超声破碎），frenchpress等。人家文献里面肯定有描述的。

那这篇文献提取的是细胞膜部分（没有细胞核膜），所以破碎的方法应该是比较温和的。比如Dounce homogenizer。仔细找找，应该在方法里面有描述。

ffaa[使用道具]
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发表于 2013-12-14 22:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我后来适当调整了下方法后，看到了目的条带，不过很淡!
为了增强效果。我购买了Pierce的膜蛋白提取试剂盒，但是我发现提出的总蛋白量很少（2μg/μl）。以前我上样的蛋白总量都在60μg，现在估计上样的蛋白总量只能到30μg,不知道能否做好!
不知战友是否用过Pierce的膜蛋白提取试剂盒,能否给点建议,另外我还能用β-actin做内参吗?谢谢!

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