小中大楼上的楼上同学你可能误解了，我不是说他的control已经足够了，我说的是他这样安排的目的是要有足够的control，并非已经足够了. 也就是相对而言， 他还可以增加很多无限多CONTROL的。就如你说的增加纯蛋白也一样不足够，因为一样可能是与抗体的非特互作结果。
个人觉你说的添加纯蛋白作为positive control是个很好的建议，真的。但不现实，不是所有蛋白都有纯化蛋白available作positive control的。 我想在此坛购买抗体作实验的，没几个同时也购买一个纯蛋白作positive control。且加positive control也不能说明该信号就是特异性抗体-抗原反应。真正能说明问题的control是免疫抑制试验。在现实实践中，加纯蛋白positive control也不常见，文献要求证明特异性的最多是一个免疫抑制实验。
另外，我个人并不怀疑WB有问题， 反而我觉楼主做的wb非常漂亮。凭个人的经验，我有99。99%的信心楼主的37kd下的带就是目的带。楼主要关心的是IP时败要如何改变的条件。
在这图片中，IP道的IgG带本身就可以作为分子量的内参，比marker更准确。完全还原的IgG分子，重链分子量是55kd，轻链是25kd。楼主的50kd marker正好与55kd IgG重链带吻合，说明楼主的50kd marker的位置实际上是55kd（有5kd的位移）。而楼主的目标带是39kd,会出现在位移了的37kd marker以下就一点不奇怪了,很正常。因此得出楼主WB不正常的结论绝对一个武断，会误导楼主同学以后的实验设计的。在37kd上下只有一条明显的目标带（+/-3kd)太正常了。50kd以上的杂带出现也很正常，在细胞中具有相同EPITOPE的蛋白多的是。楼主要证明是否目标带，做一个简单免疫抑制WB(如果是多肽抗体，厂家一般都卖抑制用多肽）就可以了。仅是我的一面之词，供楼主参考而已。
因为楼主没说明他的蛋白是否endogenous蛋白还是人工tag蛋白expression，所以能否用tag-IP我不太清楚。无端就要楼主作flag, HA抗体IP，这没啥来由啊？如果不是tag-蛋白，愣让楼主为了一个IP实验去构架一个tag-蛋白表达，这有点说不过去啊。别说国内经费少，就是国外经费足的也不会这么干的。
另外，说明书上说能ip就能ip也是武断。ip也是有条件的，在什么样buffer, pH环境，是在变性条件下能ip还是NATIVE下能IP？ 是高表达（over expression）下能IP还是能在endogenous条件下IP? 天知道厂家的IP具体条件时啥? 这么多人有时连WB也做不出来，是厂家没说能做WB? 另外，在抗体的研发中，常见的现象是: 能IP的抗体，99%都能作WB，例外的是很少数（不是说没有），能WB的抗体，却不到1/10具备native IP能力。
再有，我想强调：IP俗称免疫沉淀。可以先抗体-抗原（在lysate中）结合（此时叫抗体-抗原反应，不叫IP)，再用固相的Protein A，G与抗原-抗体复合物结合（此时叫亲和互作反应，也不叫IP）再离心把抗原-抗体复合体-proteinA固相复合体沉淀下来，从而达到将目标抗原蛋白从细胞裂解各种产物中分离纯化出来的效果，此时才叫IP。 IP也可以是固相的抗体直接与液相中的蛋白抗原反应然后离心得到纯化抗原，这是现代更先进也更高价的IP填料。你也可以先把抗体与固相Protein A亲和结合起来，把不能结合的抗体（如失去Fc区的，多抗中还有非A/G能结合的抗体）清除了再放到lysate中去俘获目标蛋白。 具体用那种方法，是没有恒定啥标准的。 无论是IP还是wb，都是抗体与蛋白的空间立体购型结合。wb是抗体与变性后的构型结合，与蛋白的一级，二级结构有关. ip要求抗体识别一级，二级，三级有时是4级（很少）结构。如果你选的抗体epitope在蛋白折叠的内部不暴露，你的抗体就只能做WB而不能作IP。
楼主的IP实验并没有杂带，而是根本就没有蛋白带（IgG带除外）。欢迎共同探讨，说的不对的也请理性指正。
