液相色谱

本人正在分离几个氨基酸衍生物，遇到大麻烦了，看能不能在这获得有价值的信息。
1. 化合物描述：一个小分子的pyrrolinzine和一个氨基酸结合，分子量250，最大吸收在220nm，推测有四个异构体（小量分析图谱可看到有三四个峰）；
2.性质描述：对酸不稳定，易分解，化合物易与甲醇，氨类反应。
3. 尝试过的条件：用C18柱(Prodigy, Luna, from Phenomenex Company),流动相用的是乙氰/水，梯度洗脱，45分钟内ACN从2%到8%。在这种情况下，偶尔可得到好的图谱，看到有3/4个不同于原料的峰，重复性差。但如果加大上样量，整个图谱变得稀奇古怪，峰强并不随上样量增加而升高，每个峰都变宽，强度没有升多少，本来几个峰retention time就差不多，这样根本峰不开了。
4.试过缓冲剂体系，乙酸铵不行，溶剂在220吸收，这样连个好的基线都得不到；50 mM磷酸盐体系也试过，重复性差；没试过甲酸铵体系，不知他的cut-off波长多少；pH值当然都是在中性偏碱。

希望大家能多给建议。

[ 本帖最后由 miracle 于 2010-7-14 17:53 编辑 ]

“但如果加大上样量，整个图谱变得稀奇古怪”可能是上样量超过柱常量引起。在一般反相柱上，流域相中也没有加入手性拆分试剂的情况下，无法分离异构体，所以你看到的几个峰可能是主成分峰与杂质。

可以试试用三氟乙酸调PH=2.0流动相比例为  三氟乙酸水溶液：乙腈=85:15  波长220nm  流速=0.5ml\min

四氢吡咯与某一氨基酸结合成酰胺是吗？这种结构怎么可能会对酸不稳定？怎么可能结合出四种异构体？即使是和谷氨酸或天冬化合反应，也只可能存在两种异构体啊！

假设楼主的物性前提都成立
1、“峰强并不随上样量增加而升高，每个峰都变宽，”说明原有的上样量已经“够”了，再上柱已超载。
2、“对酸不稳定，易分解，化合物易与甲醇，氨类反应。”这就是水/乙腈体系重复性差的原因！既然在甲醇中都不稳定，在水中就更不稳定了（水的酸性比甲醇强）。

建议：用正向体系分析。

会不会是乙腈比例不够还有峰没完全洗脱下来？加大乙腈比例，梯度走完多平衡几分钟再进样，不管出几个峰至少每次进样要能重现，再根据出峰情况调整梯度到满意的分离效果。

液相色谱是个很有效的手段，但，目标物一定是化学稳定的。建议你先做富集预处理，同时把握其相对存在状态。

最大吸收在220nm，则不能用甲酸
、乙酸、柠檬酸缓冲体系，用磷酸盐缓冲体系还有可能，因为磷酸盐的紫外吸收背景低。
但不知为何未能成功？用的磷酸盐缓冲体系的pH是多少？用pH6.5试试！

楼主，看一下要不要加一些缓冲液来改良

这个问题需要具有的混合物及其分离条件和峰图才能进一步分析，或试探解决办法。

刘慧老师的回答：
可以选用手性柱分离效果可能会好很多。