蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】做了两周了，每次都这样，欲哭无泪

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 25  1/3 123››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】做了两周了，每次都这样，欲哭无泪

nut6694[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74107
精华 1
积分 464
帖子 583
信誉分 102
可用分 3723
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-5
状态 离线
1

发表于 2013-12-15 12:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】做了两周了，每次都这样，欲哭无泪


做了两周了，每次都这样，欲哭无泪
样品：大鼠脊髓
条件：上样量15ul或20ul都试过，结果都一样，没有测定蛋白含量
电泳：60v浓缩胶，120v分离胶
湿转，100v，60m
分离胶12%，浓缩胶4%
其中ap和temed都加倍了
组织裂解液购买自博鳌森，同时购买的同学好使，
转移缓冲无sds，甲醇200和150都试过
膜pvdf，活化15s，水1m，转移buffer10m，胶转移buffer15m
做了好几次，染膜都是只有最上边三条带，顶端为大分子量
考染胶有一次全部蛋白都有，但是这次发的就不是全有了，也和1膜一样只有上班只有最大的蛋白，样品还是一样的

说一下问题：


查看积分策略说明
附件
2013-12-15 12:36
70284924.snap.jpg (20.12 KB)
 
顶部
nut6694[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74107
精华 1
积分 464
帖子 583
信誉分 102
可用分 3723
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-5
状态 离线
2

发表于 2013-12-15 12:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还是第一张膜，只是有些干了


查看积分策略说明
附件
2013-12-15 12:36
91085026.snap.jpg (26.26 KB)
 
顶部
nut6694[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74107
精华 1
积分 464
帖子 583
信誉分 102
可用分 3723
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-5
状态 离线
3

发表于 2013-12-15 12:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

第二张膜，因为当时以为是转过了，所以在第一张后边又放了第二章膜


查看积分策略说明
附件
2013-12-15 12:36
22201946.snap.jpg (29.71 KB)
 
顶部
njkph[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 114522
精华 0
积分 246
帖子 212
信誉分 100
可用分 1842
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态 离线
4

发表于 2013-12-15 12:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你总要说说你的什么样品，电泳条件之类的吧

会不会你的样品里面有些沉淀？试试看离心以后再上样
顶部
nut6694[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74107
精华 1
积分 464
帖子 583
信誉分 102
可用分 3723
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-5
状态 离线
5

发表于 2013-12-15 12:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
考染，跑了两块胶，左边是电泳后直接考染，第二张是转膜后考染，都是只看到最顶端有大概三条带，顶端为大分子量


查看积分策略说明
附件
2013-12-15 12:37
12491174.snap.jpg (21.34 KB)
 
顶部
birdfish[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74196
精华 1
积分 539
帖子 654
信誉分 102
可用分 4196
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-8
状态 离线
6

发表于 2013-12-15 12:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的最关键条件还没有说：你的蛋白样是如何制的？
顶部
nut6694[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74107
精华 1
积分 464
帖子 583
信誉分 102
可用分 3723
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-5
状态 离线
7

发表于 2013-12-15 12:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 birdfish 于 2013-12-15 12:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你的最关键条件还没有说：你的蛋白样是如何制的？

蛋白是加的博奥森的组织裂解液，按照20mg加100~200ul裂解液，然后用超声破碎的，一般超声10s就放负二十，一会儿有拿出来处理，大概处理了四次，脊髓破碎还是很容易的，然后是离心5m，12000转，取上清，加1×上样缓冲液，100度变性五分钟，再离心10~30M,然后上样
顶部
njkph[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 114522
精华 0
积分 246
帖子 212
信誉分 100
可用分 1842
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态 离线
8

发表于 2013-12-15 12:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

看你样品处理的步骤倒是没问题 你最终样品里的sds的浓度是多少？？
顶部
nut6694[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74107
精华 1
积分 464
帖子 583
信誉分 102
可用分 3723
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-5
状态 离线
9

发表于 2013-12-15 12:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 njkph 于 2013-12-15 12:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

看你样品处理的步骤倒是没问题 你最终样品里的sds的浓度是多少？？

感谢回复
sds的浓度不知道，因为是买的博奥森的wip组织裂解液，里边没有说sds的量是多少。
顶部
abc816[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77362
精华 0
积分 775
帖子 1190
信誉分 100
可用分 6817
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-16
状态 离线
10

发表于 2013-12-15 12:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我个人觉得还是最好蛋白定个量，取50ug上样
脑组织里面脂质含量比较高，也许对蛋白电泳有点影响
也许可以试试看在同一块胶上梯度上样量看看

另外我有点不明白为什么往匀浆里加的是1x loading buffer,这样终浓度还会是1x吗？

你的marker似乎跑的也不是非常好看，扩散的有点严重
顶部
 25  1/3 123››