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标题:【求助】本人做Western blot一直没有条带出来

youyou99[使用道具]
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发表于 2013-12-16 15:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】本人做Western blot一直没有条带出来


本人做WB有一个月了，一直都郁闷着。没有一次出现条带。
现在把我的实验步骤贴出来，希望各位高手能指点一下，提出一些解决方案

1，提蛋白，BCA法检测蛋白浓度30-40微克/微升

2，电泳：0.75的进口板子，每孔上样2微升，80V一跑到底，然后考兰染胶，条带明显，效果比较 好，没有“微笑，皱眉”现象

3，转膜：0.22的PVDF膜，0.25mA恒流，25的分子量转膜25-30分钟，45的分子量转膜45-50分钟，转膜后，可以很清楚的看到maker。但是用丽春红染色，没有看到蛋白条带

4，5%的脱脂奶粉，配方1g奶粉加20mlPBST，37度封闭2个小时

5，孵育一抗，按照点杂交的结果两个抗体均使用1：200的浓度，每张膜上加60微升的稀释抗体
37度90分钟，或者4度过夜

6，用PBST洗3次，每次10分钟

7，孵育二抗，按照1：5000的浓度每张膜上加60微升的稀释抗体，37度50-60分钟

8，用PBST洗3次，每次10分钟

9，用ECL法发光

以上就是我的操作步骤，请各位就怀疑的地方提出疑问，一直没做出来，很是郁闷。。。。
谢谢
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abc816[使用道具]
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发表于 2013-12-16 15:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主，丽春红染色有没有的话，基本就是转膜的问题了，后面也就没必要做了。

楼主是写错了吧，转膜一般都是100~200mA，另外转膜的时间也短了些，200mA，时间上增加一倍差不多了，先用丽春红染上色再看吧
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tuuu2[使用道具]
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发表于 2013-12-16 15:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

楼主是转膜结束后考马斯亮蓝染胶还是转膜之前就染胶了？？
转膜之前就染胶似乎不对吧？
考染是非可逆性的染色，染上去就脱不掉，可能影响后面的转膜
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发表于 2013-12-16 15:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议循序渐进地做。

首先提蛋白，摸索不同的上样量走电泳，然后用考马斯亮蓝把胶染色，看是否提取出了蛋白，看是否走出了梯度；

然后如果胶上能成功走出蛋白条带，再转膜，转过的膜用立春红染色，看是否转膜成功；同时转过膜的胶再用考马斯亮蓝染色，看转膜效果；

如果能成功转膜，再按照上述条件电泳，转膜，然后用Actin 一抗体染，二抗体染，看能否染出来条带，

如果能成功染出Actin，再用目的蛋白一抗体染目的蛋白，一般要增加抗体浓度，以便成功染出条带
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发表于 2013-12-16 15:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你转膜条件错了吧？我们一般都是5mA/cm2

怎么能恒流呢？

时间上倒不觉得短了，我们都是45分钟，都挺好的

另外，我们封闭就室温两小时就行了。如果用快速封闭液，二十分钟足够。
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发表于 2013-12-16 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 DONT 于 2013-12-16 15:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你转膜条件错了吧？我们一般都是5mA/cm2

怎么能恒流呢？

时间上倒不觉得短了，我们都是45分钟，都挺好的

另外，我们封闭就室温两小时就行了。如果用快速封闭液，二十分钟足够。
...

我们用的是湿转法，你们用的是半干吧
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发表于 2013-12-16 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不应该用考染吧，考染就意味着已经固定了，蛋白还能转过膜吗？
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