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标题:【求助】原核表达问题

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发表于 2013-12-16 15:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】原核表达问题


原核表达时，经PCR以及酶切检测，确定已经把目的基因克隆到pET系列载体上了，但是就是没有表达，我手上有3个基因，都是这样。

我是先目的基因PCR后连pMD19，挑10个单克隆，抽质粒后，把质粒混合后再酶切，才连到pET系列载体上的。

希望大侠们指导下
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发表于 2013-12-16 15:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果你确认你载体构建没有问题，那就换表达菌试试，如果还是不行那就换载体，还是不行的话就只能换表达系统试试了。祝好运！
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发表于 2013-12-16 15:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如楼上所说的，首先要确保载体构建没有问题，不知道你用的是什么pET载体，不同的pET载体在引物设计上需要注意，例如pET28b与a相比会有一个碱基的移位，因此在设计上游引物时需要在酶切位点之后多加一个碱基，从而使表达的时候能正确翻译你的目的蛋白，如果没有多加一个碱基，那么你的目的基因全部移位，可能在翻译起始就会遇上终止密码子.当然，如果这些都没有问题的话，可以采纳楼上所说的换载体或换表达菌株，另外，补充稀有密码子也可以考虑考虑！
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发表于 2013-12-16 15:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也想请教一下，我用两种同源蛋白构建了两个载体，同样的载体以及表达菌株，可是一个表达了。另一个缺怎么也表达不出来是怎么回事啊？？
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flower-201[使用道具]
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发表于 2013-12-16 15:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

会不会是载体有问题啊？
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831226[使用道具]
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发表于 2013-12-16 15:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

各位大侠，
本人刚开始要做PET表达，想请问下，谁有PET表达手册啊
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duoduo[使用道具]
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发表于 2013-12-16 15:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 831226 于 2013-12-16 15:57 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

各位大侠，
本人刚开始要做PET表达，想请问下，谁有PET表达手册啊

请用页面右上方的搜索。
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BOSS2011[使用道具]
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发表于 2013-12-16 15:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

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发表于 2013-12-16 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有没有测序，测序结果能帮助你看到是否能正确表达目的蛋白

很多时候双酶切并不准确（尤其实验室公用酶，载体什么的）

目的蛋白是原核还是真核的？
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zhenxin[使用道具]
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发表于 2013-12-16 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
目的基因片段是2400bp，是不是很长不好表达啊？我的也是一直没有表达出来，不知道什么原因呢。用的是bL21，pet32a载体，连接后PCR反应阳性，但是不表达蛋白/请问这是怎么回事啊？
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