蛋白质与蛋白组学 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】2-D图上几乎没有蛋白点，这是为什么啊？

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】2-D图上几乎没有蛋白点，这是为什么啊？

bohe221[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74583
精华 0
积分 419
帖子 457
信誉分 100
可用分 3228
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-12
状态 离线
1

发表于 2013-12-16 21:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】2-D图上几乎没有蛋白点，这是为什么啊？


众位大侠前辈们：实验材料为白色玫瑰花（花边缘略带粉色或青色），花店里买的！跑出来的2-D没点！这是为什么啊？
条件：蛋白复溶时为浅棕色，1.2mg上样量，聚焦70000VH，12% SDS-PAGE，恒功率！
第一次和第二次是一样的材料和条件！


查看积分策略说明
附件
2013-12-16 21:42
61931603.snap.jpg (29.29 KB)
 
顶部
bohe221[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74583
精华 0
积分 419
帖子 457
信誉分 100
可用分 3228
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-12
状态 离线
2

发表于 2013-12-16 21:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这是第二次的图！


查看积分策略说明
附件
2013-12-16 21:42
91445556.snap.jpg (30.69 KB)
 
顶部
guagua[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 72040
精华 2
积分 732
帖子 1016
信誉分 104
可用分 5955
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-9-3
状态 离线
3

发表于 2013-12-16 21:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
很可能是蛋白降解掉了，另外胶条表面可能是被划了或者缓冲液不是特别干净，很多竖条纹。
顶部
bohe221[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74583
精华 0
积分 419
帖子 457
信誉分 100
可用分 3228
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-12
状态 离线
4

发表于 2013-12-16 21:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢前辈的指教！
蛋白降解掉了？这个倒是很有可能，可是为什么呢？样品制备过程是一个人弄得啊，上边的图是我做的一向和二向，后面的图别人做的过程也没问题啊！
胶条表面倒是没被划，水化完毕后胶条表面上有很多棕色的东西残留，那些东西上样前离心也去不掉！缓冲液不干净这个不大可能吧？！我下次自己做一下全过程看看结果吧！
谢谢你啦！
顶部
vcve[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76131
精华 0
积分 743
帖子 1043
信誉分 101
可用分 6126
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
5

发表于 2013-12-16 21:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
感觉蛋白提取出了问题，用丙酮多沉淀一两遍吧，另外，但是溶解的时候注意要溶解充分！
顶部
bohe221[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74583
精华 0
积分 419
帖子 457
信誉分 100
可用分 3228
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-12
状态 离线
6

发表于 2013-12-16 21:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢前辈的指教！

我用的是醋酸氨/甲醇沉淀的，用80%丙酮洗涤两次！溶解的时候蛋白全部溶解，不粘稠。除了有些棕色外，溶液看起来也比较清亮!

反正最近一段时间遇到困难超多，还请前辈们多多指点！提前谢谢大家了！
顶部
vcve[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76131
精华 0
积分 743
帖子 1043
信誉分 101
可用分 6126
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
7

发表于 2013-12-16 21:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

用100%的丙酮洗吧，别忘了在丙酮里田间0.07%的DTT，洗三遍
顶部
bohe221[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74583
精华 0
积分 419
帖子 457
信誉分 100
可用分 3228
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-12
状态 离线
8

发表于 2013-12-16 21:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢前辈的指点！
能告诉我这是为什么吗？我师兄也做蝴蝶兰花瓣蛋白，没有用100%的丙酮洗，只用80%丙酮洗了，做的图也不错！ 我做的是玫瑰花瓣蛋白，蛋白提取过程及结果都不叫人满意，却不知道原因何在！请前辈指教，谢谢！！
顶部
vcve[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76131
精华 0
积分 743
帖子 1043
信誉分 101
可用分 6126
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
9

发表于 2013-12-16 21:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一般用丙酮沉淀都是100%的丙酮沉淀比较普遍一些，至于为什么别人做的好，而你做不好，估计还是实验操作的一些细节的差异，你把等电聚焦时间适当延长一些，然后改用100%丙酮沉淀几次，试一下看，应该会有一些改观的，另外，下次贴图的时候最好把详细的实验过程和步骤也贴上来，这样大家才可以比较并提出意见和建议，祝顺利！
顶部
bohe221[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74583
精华 0
积分 419
帖子 457
信誉分 100
可用分 3228
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-12
状态 离线
10

发表于 2013-12-16 21:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

好的！谢谢前辈的指教！我现在已经对样品制备这一步的重要性深有体会！
顶部