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标题:【求助】western连内参都暴不出

XYZQ[使用道具]
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发表于 2013-12-16 22:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】western连内参都暴不出


各位师兄师姐老师
你们好，最近在做western ，目的蛋白55kd
最近开始做western，但是连内参GAPDH都暴不出来，我用的是碧云天RIPA裂解液，提六孔板的蛋白，一个孔加150ul，这个裂解液里面有磷酸酶抑制剂，我自己还另外加了一点NaF和钒酸钠，也用了碧云天的BCA蛋白定量试剂盒，我用5ul的蛋白加15ul的PBS稀释，测出来的蛋白浓度是4点多，那总浓度就是差不多16点（稀释4倍，所以分光光度计读出的浓度再乘以4,没错吧？？？？）
western的时候蛋白50ug等样上样，跑胶先60v抛出浓缩胶后改用120v，一般总时间可能差不多要2个小时，转膜200mA 90min，我用了trans的彩虹maker dm111，这里我就有一点奇怪的，跑胶的时候100.62.40.30.24kd的条带都很清楚的在胶上，但是转膜后40.30.24kd的条带也都转到膜上了，但是62.100kd的条带在膜上没有，胶上也没有，按道理应该不会转过的呀，因为40.30.24kd的条带都还在膜上，62.100kd的分子量更大的，更不可能转过的呀，我就不知道这其中是不是出了什么差错的？
最后转膜完，考马斯亮蓝染胶，胶上的蛋白几乎是看不到的，蛋白泳道也非常的浅，要很仔细的看才能看到很模糊的泳道，丽春红染膜也什么都看不到的，最后发光连内参都暴不出来的，换了实验室其他人的二抗和发光液也都暴不出来，所以推想应该不是二抗和发光液的问题，一抗之前师兄也做得很好的
所以想请教大家，帮忙看一下我这其中的过程是不是有什么地方错了，真是很郁闷呢，连内参都暴不出来的，我自己觉得会不会是蛋白的问题呢，蛋白浓度这样计算有没有错误的？谢谢！
比较急
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abc816[使用道具]
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发表于 2013-12-16 22:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
问一下：你的六孔板中细胞有多少？确定蛋白浓度的测定及计算是正确的吗？因为我也用过跟你同样的碧云天的产品提蛋白及测蛋白浓度，个人觉得六孔板一个孔加150ul裂解液提的蛋白浓度应该不会那么高。
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wu11998866[使用道具]
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发表于 2013-12-16 22:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

膜上的蛋白很少。首先看一下你的蛋白浓度测定有没有问题，最好让别人帮你测一下，再比较你自己测的结果。如果没问题，看你的转膜有没有问题。
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bling[使用道具]
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发表于 2013-12-16 22:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我跟你一起悲惨，只有第一次除了条带，后面都没有，他们怀疑是提的蛋白有问题。
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发表于 2013-12-16 22:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
蛋白浓度可能没有那高，尝试加高上样量试试；转膜时62、100的marker没有转上，说明转膜效率不够，建议改良下转膜条件试试。
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birdfish[使用道具]
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发表于 2013-12-16 22:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
decrease the concentration of 1st,2nd antibody bravely
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发表于 2013-12-16 22:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我试过了，不稀释蛋白，也不管是否等量上样的，就直接16ul加4ul的上样buffer，跑胶后染胶胶上的蛋白条带很浅，这样子是不是就说明蛋白浓度不够的，蛋白量太少啦？谢谢！
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发表于 2013-12-16 22:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
强烈建议看看该帖，和你是类似的问题。good luck!

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发表于 2013-12-16 22:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

虽然不敢打包票，但是你细胞的浓度一般情况下不可能有这么高，细胞浓度超过10的话都要超过组织了，其实超过5都是比较少了。还有看你后面括号里说到用的分光光度计，建议改用酶标仪，准确度会高。
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发表于 2013-12-16 22:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你养的细胞蛋白很多吗？六孔板，每个孔加150ul，最后才用大概十几ul，一听就是上样上得太少了。建议你一个孔加50ul左右，最后上样时每个泳道加入至少50ug的蛋白。一般的细胞这么上样两次就用光了。以你的意思估计目的蛋白也没有杂出来吧。这么少的上样量的确不好杂。
不知道你RIPA的使用是否正确，不过我们这里用单去污的要超声，用三去污的要静置。裂解液都是自己配的，觉得自己配的更好用。
转膜肯定是没有转过，更可能是没转够，还是把时间加倍吧，如果用的膜孔径不是太大，0.2um的不会转过的。
不是每种细胞的内参都适合用GAPDH，你也可以用用别的内参如b-actin的。
如果怕是上样量的问题可以不转膜就直接染考马，确定出有明确的染色之后再转膜，转膜后也可以再染一次丽春红，而后再上抗体。
一养的细胞状态一定要好，如果细胞本身的状态不好或者你的刺激是有毒性或者对细胞生长有抑制那么内参也是杂不出来的，尤其是GAPDH这样代谢性的内参蛋白。
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