蛋白质与蛋白组学

宿主菌为BL21(DE3) 表达载体为pET30a(+) N端HisTag
目的融合蛋白20kDa左右，是含7个半胱氨酸残基的TGFbeta超家族的因子nodal（二聚体有活性）
用的是IPTG诱导（OD600=0.6-0.8） 终浓1mM , 180rpm,25度x10h
可是表达量很低，且上清和沉淀各占50%，收上清做HisTrap亲和层析。

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表达量很低的上清去做Ni柱，60kd条带是杂质的可能性极大，大肠杆菌在此位置左右有Ni柱吸附蛋白，如果表达量大，相对量效应会使得电泳不明显。

100mL培养液（收样时OD600~=1.6），10mLbinding buffer 重悬后分三批超声，25%超3min(5s/10s).

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问题一：收集的菌体为黑色，-20度放上几天黑色加深，很奇怪，请问有没有人知道为什么？
可能与表达的蛋白有关。

问题二：超声，离心后过0.22uM滤膜，发现20mL（第二次）就堵滤膜了，后续试验发现我的蛋白也堵亲和柱和凝胶柱，难道是蛋白粘性太大？

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哪来的20ml，你总共不是10mLbinding buffer 重悬？
超声时间可能不够，样品粘度大；
离心时间可能不够，沉淀离心不完全；
倾倒上清的操作可能带入了沉淀；
未见柱操作条件，如平衡buffer等。