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标题:【求助】western 结果和RT-PCR结果怎么会完全相反？

ffaa[使用道具]
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发表于 2013-12-16 23:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】western 结果和RT-PCR结果怎么会完全相反？

最近碰到了一件很郁闷的事情，请大家帮忙看看，怎么解释，下一步有什么办法解决问题。
小妹的课题是研究一个抑癌基因的表达调控及功能。开始的时候用RT-PCR的方法检测了该基因在肿瘤细胞系和正常上皮细胞系中的表达差异，结果显示该基因仅在正常细胞系中表达，在实验室现有的7个肿瘤细胞系中都不表达，当时因为研究的基因表达调控机制是转录水平的，所以就没有再用western的手段进行验证。先上图。
左上方即该基因的表达情况，下方是管家基因。


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2013-12-16 23:13
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ffaa[使用道具]
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发表于 2013-12-16 23:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

近来因为要研究该基因的功能，所以构建了该基因的表达载体，并进行了稳定转染。
RT-PCR再次证实了该基因在某细胞中，转染前没有表达，转染后表达显著增高。
可是对此结果进行western验证的时候，恐怖的事情出现了，western显示该基因在转染前既有表达，转染后量也没有显著的增多。我的一抗是多克隆抗体，1：1000的比例做的，说明书上文字部分的蛋白大小是33KD，电泳图是28KD，而我的实验结果不知道为什么在近似的地方出现了两条带，位置和说明书都有出入。大小一个比35大一点，一个比25小一点。两条明显的带之间还有几条分不开的条带，我不知道是在压片的时候动了造成的影子还是确实有条带但是分不开？？？请教高人这怎么解释，如何解决？
眼看还有一个多月实验就要结束了，RT-PCR和western结果却出现了这样颠覆性的差异。以前的RT-PCR我当时重复了很多次，引物比对也没有问题。现在该怎么办啊 ，有什么合理的解释吗？请大家一定帮帮我啊
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lixi559[使用道具]
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发表于 2013-12-16 23:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
下面的条带应该是压片的时候移动的结果，而且你的这个明显过度曝光了，你应该压更短的时间。你确定你构建的高表达的质粒的读码框没有问题吗，如果发生了移码突变的话，也有可能PCR能检测出来，WB就没法检测到了。
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发表于 2013-12-16 23:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 lixi559 于 2013-12-16 23:13 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
下面的条带应该是压片的时候移动的结果，而且你的这个明显过度曝光了，你应该压更短的时间。你确定你构建的高表达的质粒的读码框没有问题吗，如果发生了移码突变的话，也有可能PCR能检测出来，WB就没法检测到了。 ...

您好 非常感谢您的回复。
不过我的情况是：PCR没有检测出来，而是western有表达。
在转染前后我也做了RT-PCR验证，确定之前的细胞和转染空载体的细胞都没有该基因表达，而转染后可以有明显表达，要是读码框改变的话，是不是用该基因的引物是不能够P出条带的。
其实，我更困惑的是，为什么未转染细胞RT-PCR没有该基因表达，western就检测出来了呢？
因为我是学临床的，基础知识实在是不够啊，请您多多指点！谢谢。
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发表于 2013-12-16 23:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

RNA水平与蛋白质水平不一直是常有的
存在转录后的调控 你转录成了RNA以后也不一定就翻译成蛋白质。
你说的未转染的细胞RT没表达Western出来了 那可能是在转染前细胞本身就表达了该蛋白
在转染后该蛋白的稳定性加强或是其他什么原因 导致该蛋白的存在
不知道你有没用正常细胞做Westren 可以试着看下
总之RNA与蛋白质水平不一致是很正常的现象、
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发表于 2013-12-16 23:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可是对此结果进行western验证的时候，恐怖的事情出现了，western显示该基因在转染前既有表达，转染后量也没有显著的增多。
这是你说的
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发表于 2013-12-16 23:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那请教一下，为什么转染前细胞本身就表达了蛋白，那么在转录水平却测试不出来呢？
呵呵，做个不恰当的比方，那不是妈和孩子的关系吗？没有mRNA，哪里来的蛋白呢？
没妈孩子是怎么跑出来的呢？
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ffaa[使用道具]
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 小中大


QUOTE:
原帖由 04906 于 2013-12-16 23:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

可是对此结果进行western验证的时候，恐怖的事情出现了，western显示该基因在转染前既有表达，转染后量也没有显著的增多。
这是你说的

对啊 所以我不明白是怎么回事啊 是RT-PCR有问题 还是western有问题？有什么合理的解释吗？
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04906[使用道具]
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 小中大


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原帖由 ffaa 于 2013-12-16 23:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


对啊 所以我不明白是怎么回事啊 是RT-PCR有问题 还是western有问题？有什么合理的解释吗？

你的抗体是多抗，你也不能肯定那条最亮带就是目的条带，也有可能是杂带呢，你需要有个RT-PCR检测是阳性的细胞做个对照。
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